הדמיית FLIM-FRET לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בחיידקים חיים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:26 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות בחיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי, FLIM, בשילוב עם העברת אנרגיית תהודה של פורסטר, FRET, מתחילים בתרחיף חיידקי רקומביננטי. החיידקים מבטאים חלבונים ציטופלזמיים ספציפיים המעורבים במסלולים מטבוליים, המסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים תורמים ומקבלים המתאימים ל-FRET.
זהו את תרחיף החיידקים על כרית אגרוז, המשתקת את החיידקים בשקופית מיקרוסקופ. הנח כיסוי על המגלשה ואטום.
מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ סריקה הפוך של עירור שני פוטונים למיקרוסקופ FLIM-FRET. השתמש במנורת פלואורסצנטיות כדי לבחור ולסרוק אזור מעניין בחד-שכבת החיידקים.
האינטראקציה בין החלבונים הציטופלזמיים המבוטאים מקרבת את החלבונים הפלואורסצנטיים של התורם והמקבל בכיוון מתאים. עם תאורת לייזר באורך גל מתאים, החלבון הפלואורסצנטי התורם מתרגש.
הקרבה של חלבונים פלואורסצנטיים מפעילה FRET, מה שמוביל להעברת אנרגיה לא קרינה מחלבונים פלואורסצנטיים תורמים למקבלים, אשר מתרגשים ובסופו של דבר חוזרים למצב הקרקע, ופולטים פלואורסצנטיות.
העברת האנרגיה הלא קרינה מפחיתה את הזמן שלוקח לחלבון הפלואורסצנטי של התורם הנרגש לחזור למצב הקרקע שלו, אורך החיים הקרינה של התורם - נמדד על ידי FLIM. הירידה באורך החיים הקרינה הממוצע של החלבון הפלואורסצנטי התורם עקב FRET מאשרת את האינטראקציה בין חלבון לחלבון
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים