בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

התחל את בדיקת קשירת הקרבה על ידי לקיחת נמטודות מנותחות וקיבועם על שקופית כשתאי קו הנבט שלהן חשופים. תאים אלה מציגים רמות גבוהות של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין המכילים חלבונים קושרי RNA, RBPs, הקשורים לחלבונים השותפים שלהם.

כיסו את השקופית בשני נוגדנים עיקריים המזהים שני חלבוני מטרה ספציפיים - ה-RBP והחלבון השותף שלו. השלם את השקופית עם שני סוגים של נוגדנים משניים ספציפיים לנוגדנים הראשוניים שלהם.

כל נוגדן משני מצומד לבדיקות PLA - גדילי DNA עם רצפים משלימים. הנוגדנים המשניים נקשרים לנוגדנים הראשוניים המחוברים מראש, ומקרבים את שתי בדיקות ה-PLA.

החל את מאגר הקשירה המכיל אוליגונוקלאוטידים מחברים - שמתכלאים עם בדיקות PLA - ואנזים ליגאז אוטם את הפער ויוצר DNA מעגלי. דגרו את השקופית עם תמיסת הגברה המכילה DNA פולימראז, dNTPs ובדיקות גלאים המחוברות לפלואורופור אדום.

באמצעות ה-DNA המעגלי כתבנית, הפולימראז יוזם הגברה של מעגל מתגלגל, ויוצר עותקים רבים של ה-DNA של התבנית המחוברים זה לזה. ה-DNA המוגבר נשאר קשור לבדיקת ה-PLA, מה שמאפשר לוקליזציה של אינטראקציה בין חלבון לחלבון.

בדיקות הגלאי, הנושאות אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים קצרים, מקיימים אינטראקציה עם האזורים המשלימים של ה-DNA המוגבר, יוצרים דופלקסים ומעבירים אותות פלואורסצנטיים למתחמי חלבונים. דמיין את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ש