בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

התחל את בדיקת קשירת הקרבה על ידי לקיחת נמטודות מנותחות וקיבועם על שקופית כשתאי קו הנבט שלהן חשופים. תאים אלה מציגים רמות גבוהות של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין המכילים חלבונים קושרי RNA, RBPs, הקשורים לחלבונים השותפים שלהם.

כיסו את השקופית בשני נוגדנים עיקריים המזהים שני חלבוני מטרה ספציפיים - ה-RBP והחלבון השותף שלו. השלם את השקופית עם שני סוגים של נוגדנים משניים ספציפיים לנוגדנים הראשוניים שלהם.

כל נוגדן משני מצומד לבדיקות PLA - גדילי DNA עם רצפים משלימים. הנוגדנים המשניים נקשרים לנוגדנים הראשוניים המחוברים מראש, ומקרבים את שתי בדיקות ה-PLA.

החל את מאגר הקשירה המכיל אוליגונוקלאוטידים מחברים - שמתכלאים עם בדיקות PLA - ואנזים ליגאז אוטם את הפער ויוצר DNA מעגלי. דגרו את השקופית עם תמיסת הגברה המכילה DNA פולימראז, dNTPs ובדיקות גלאים המחוברות לפלואורופור אדום.

באמצעות ה-DNA המעגלי כתבנית, הפולימראז יוזם הגברה של מעגל מתגלגל, ויוצר עותקים רבים של ה-DNA של התבנית המחוברים זה לזה. ה-DNA המוגבר נשאר קשור לבדיקת ה-PLA, מה שמאפשר לוקליזציה של אינטראקציה בין חלבון לחלבון.

בדיקות הגלאי, הנושאות אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים קצרים, מקיימים אינטראקציה עם האזורים המשלימים של ה-DNA המוגבר, יוצרים דופלקסים ומעבירים אותות פלואורסצנטיים למתחמי חלבונים. דמיין את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שימו לב לכתמים אדומים מובהקים בתוך התא, המעידים על אינטראקציות חלבון-חלבון מוצלחות.

השתמש בדילול הנוגדנים כדי לדלל את הנוגדנים העיקריים. יש למרוח 40 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הראשונית המדוללת לכל שטח של 14 על 14 מילימטר על השקופיות. מניחים את המגלשות בתא לח, ודוגרים למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.

בבוקר יש לשטוף את השקופיות פעמיים למשך 5 דקות כל אחת עם 50 מיליליטר של מאגר כביסה 1x A בטמפרטורת החדר בצנצנת קופלין. הנח את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי המוגדר ל-60 סל"ד. הנח את השקופיות על מגבת נייר כדי לאפשר למאגר הכביסה לברוח מהשקף, ונגב בעדינות את הקצוות.

הכן תמיסה של 40 מיקרוליטר המכילה בדיקות פלוס מינוס. הוסף את הפתרון לכל שטח של 14 על 14 מילימטר. דגרו את המגלשות בתא לח למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את השקופיות פעמיים במשך 5 דקות כל אחת עם 50 מיליליטר של מאגר כביסה 1x A בטמפרטורת החדר בצנצנת קופלין.

הנח את צנצנת קופלין על שייקר מסלולי המוגדר ל-60 סל"ד. מדללים את מאגר הקשירה 1 עד 5 במים טהורים במיוחד. השתמש במאגר זה כדי לדלל את הליגאז 1 עד 40 כדי להכין מלאי תקין של תמיסת קשירה. הנח את השקופית על מגבת נייר כדי לתת למאגר הכביסה לזרום מהצדדים, ונגב בעדינות את הקצוות.

הוסף 40 מיקרוליטר מתמיסת הקשירה לכל שטח של 14 על 14 מילימטר. דגרו את המגלשות בתא לח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה וייבוש השקופיות כמתואר קודם לכן, הוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה טרייה מוגנת מאור לכל שטח של 14 על 14 מילימטר.

דגרו את המגלשות בתא החשוך והלח למשך שעה ו -40 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את השקופיות פעמיים במשך 10 דקות כל אחת עם 50 מיליליטר של מאגר כביסה 1x B, ושטפו את השקופיות פעם אחת למשך דקה אחת עם 50 מיליליטר של מאגר כביסה 0.01x B.

לאחר ציור ההיקף המצופה אפוקסי של השקופית, הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה לכל דגימה, והניח בעדינות כיסוי מעל, מה שמאפשר למדיום ההרכבה להתפשט. צבעו סביב קצה הכיסוי עם לק כדי לאטום את הכיסוי ולהחליק. הימנע מהזזת הכיסוי. תנו ללק להתקשות לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.