עיכול חלבונים על הממברנה להכנת חלבונים בעלי קו-אימונוזיקציה למחקרי אינטראקציה

כדי לבצע עיכול על הממברנה, קח תמיסה של קומפלקסים של חלבונים משקעים חיסוניים, שכל אחד מהם מכיל חלבון מטרה רקומביננטי מתויג GFP הקשור לחלבון השותף שלו.

מעבירים את החלבונים לצינור המכיל פוליווינילידן דיפלואוריד רטוב מראש, קרום PVDF ודוגרים. המשטח ההידרופילי של קרום ה-PVDF מסייע בהעברת החלבונים אל הממברנה.

העבירו את הממברנה המכילה חלבון לצינור טרי. הוסף חיץ המכיל חומר מפחית כדי להפחית את קשרי הדיסולפיד בין שאריות הציסטאין, מה שמוביל לדנטורציה של החלבונים הבודדים במתחמים מבלי להפריע לאינטראקציה ביניהם.

החלף תמיסה זו במגיב אלקילטי, אשר אלקילט את קבוצת הסולפידריל של שני החלבונים במתחמים ומונע היווצרות של קשרי דיסולפיד. שטפו את הממברנה כדי להסיר כל מגיב עודף.

טפלו בקרום עם חוצץ המכיל טריפסין - אנזים פרוטאוליטי. טריפסין מבקע את חלבון המטרה המתויג על ידי GFP ואת החלבון השותף שלו במסוף הקרבוקסיל של שאריות הארגינין והליזין, ומשחרר את הפפטידים הקטנים יותר לתוך הסופרנטנט. העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה.

שוטפים את הממברנה בתמיסה חומצית, מנתקים את כל הפפטידים הקשורים מהקרום, ומבטיחים מיצוי מלא. משוך את השברים המכילים פפטיד לתוך צינור יחיד. ייבוש באמצעות ייבוש ואקום.

השעו מחדש את השאריות בריכוז נמוך של חומצה פורמית, תוך המסת הפפטידים, המוכנים לזיהוי אינטראקציה בין חלבון לחלבון.

להכנת הממברנה, חותכים ממברנות PVDF לחתיכות בגודל 3 מילימטר על 3 מילימטר באמצעות מספריים כירורגיים שנוקו מיד לפני השימוש. מניחים את חתיכות הממברנה על נייר אלומיניום, ומוסיפים 2 עד 5 מיקרוליטר אתנול לכל חתיכה. לפני שהממברנות יבשות לחלוטין, הוסיפו 2 עד 5 מיקרוליטר של חומר החלבון לכל חתיכה, וייבשו אותם באוויר עד שמשטח הממברנה הופך מט.

לאחר מכן, העבירו ממברנות לצינורות של 1.5 מיליליטר, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אם משתמשים מיד, הוסיפו 2 עד 30 מיקרוליטר אתנול, מה שיהפוך אותם להידרופילים. הסר את האתנול בעזרת פיפטה. אך לפני שהממברנות מתייבשות, הוסיפו לחלוטין 200 מיקרוליטר של תמיסת תגובה מבוססת DTT לכל צינור, ודגרו אותם בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה, החלף את תמיסת התגובה ב -300 מיקרוליטר של תמיסת יודואצטמיד, ודגירה בחושך למשך 45 דקות. לאחר מכן, שטפו את הממברנות פעמיים במים מזוקקים, ופעם אחת עם 2% אצטוניטריל על ידי מערבולת למשך 10 שניות לפחות.

עבודה עם דיתיותרייטול ואצטוניטריל עלולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יש ללבוש מסכה, משקפיים וכפפות בעת ביצוע הליך העיכול על הממברנה.

מכינים טריפסין לפי הוראות כתב היד, ומוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת תגובת טריפסין לכל ממברנה. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול.

למחרת, העבירו את תמיסת התגובה לצינור נקי של 1.5 מיליליטר, והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסות שטופות לקרום. דגרו את הממברנה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, אספו את התמיסה השטופה וערבבו אותה עם תמיסת התגובה. הוסף עוד 100 מיקרוליטר של תמיסה שטופה לקרום, ועשה סוניקציה למשך 10 דקות. לאחר מכן, אספו את התמיסה השטופה וערבבו אותה עם תמיסת התגובה. מכסים את המבחנה בחתיכת סרט מעבדה, ויוצרים חורים קטנים בסרט בעזרת מחט.

יבש את התמיסה באמצעות רכז ואקום, והמיס את השאריות ב -10 מיקרוליטר של 0.2% חומצה פורמית. צנטריפוגה של הצינור ב-12,000 x גרם למשך שלוש דקות, והעבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת דגימה.

נתח את הדגימה באמצעות ספקטרומטר מסה המקושר למערכת HPLC ננו-LC.