עיכול חלבונים על הממברנה להכנת חלבונים בעלי קו-אימונוזיקציה למחקרי אינטראקציה

כדי לבצע עיכול על הממברנה, קח תמיסה של קומפלקסים של חלבונים משקעים חיסוניים, שכל אחד מהם מכיל חלבון מטרה רקומביננטי מתויג GFP הקשור לחלבון השותף שלו.

מעבירים את החלבונים לצינור המכיל פוליווינילידן דיפלואוריד רטוב מראש, קרום PVDF ודוגרים. המשטח ההידרופילי של קרום ה-PVDF מסייע בהעברת החלבונים אל הממברנה.

העבירו את הממברנה המכילה חלבון לצינור טרי. הוסף חיץ המכיל חומר מפחית כדי להפחית את קשרי הדיסולפיד בין שאריות הציסטאין, מה שמוביל לדנטורציה של החלבונים הבודדים במתחמים מבלי להפריע לאינטראקציה ביניהם.

החלף תמיסה זו במגיב אלקילטי, אשר אלקילט את קבוצת הסולפידריל של שני החלבונים במתחמים ומונע היווצרות של קשרי דיסולפיד. שטפו את הממברנה כדי להסיר כל מגיב עודף.

טפלו בקרום עם חוצץ המכיל טריפסין - אנזים פרוטאוליטי. טריפסין מבקע את חלבון המטרה המתויג על ידי GFP ואת החלבון השותף שלו במסוף הקרבוקסיל של שאריות הארגינין והליזין, ומשחרר את הפפטידים הקטנים יותר לתוך הסופרנטנט. העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה.

שוטפים את הממברנה בתמיסה חומצית, מנתקים את כל הפפטידים הקשורים מהקרום, ומבטיחים מיצוי מלא. משוך את השברים המכילים פפטיד לתוך צינור יחיד. ייבוש באמצעות ייבוש ואקום.

השעו מחדש את השאריות בריכוז נמוך של חומצה פורמית, תוך המסת הפפטידים, המוכנים לזיהוי אינטראקציה בין חלבון לחלבון.

להכנת הממברנה