בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

מוות מתוכנת-1, PD-1, חלבון קולטן פני התא, מכיל שני מוטיבים של טירוזין ציטופלזמי - המוטיב המעכב, ITIM, ומוטיב המתג, ITSM. קשירת ליגנד גורמת לזרחון ITIM ו-ITSM וגיוס חלבון טירוזין פוספטאז SHP2 לתחום הציטופלזמי של PD-1, מה שמפעיל מפל איתות במורד הזרם.

כדי לחקור אינטראקציות SHP2-PD-1 באמצעות בדיקת קו-אימונו-משקעים, השג תרבית תאי אפיתל דביקה. תאים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק, PD-1 מסוג פרא מתויג GFP עם ITIM ו-ITSM זרחניים. השג תאי אפיתל המבטאים מוטציה PD-1 מתויגת GFP, שבה מוטציות ITIM או ITSM מעכבות את הזרחן שלהם.

הוסף מאגר ליזה המכיל חומר ניקוי ונתרן אורתוונדאט. חומרי הניקוי מפרקים את התאים, וגורמים לשחרור חלבון PD-1 מתויג GFP. חסימות נתרן אורתוואנדאט שחררו פוספטאזים, ובכך מנעו דה-פוספורילציה של ITIM ו-ITSM.

צנטריפוגה הליזאט. העבירו את הסופרנטנט המכיל חלבון לצינורות טריים. הוסף חרוזי אגרוז מצופים נוגדנים נגד GFP. חלבוני ה-PD-1 המתויגים ב-GFP נקשרים לנוגדנים נגד GFP.

דגירה עם מתלה SHP2. ה-PD-1-GFP הקשור בחרוזים קושר את SHP2 באמצעות ה-ITIM וה-ITSM הזרחניים.

הוסף את מאגר Laemmli והרתיח כך שחומרי ההפחתה וחומרי הניקוי במאגר יפגעו במתחמי החלבון PD-1-GFP-SHP2. צנטריפוגה ולאסוף את הסופרנטנט המכיל את קומפלקסי החלבון המפורקים. בצע SDS-PAGE וכתם מערבי.

PD-1 מסוג פרא ומוטציה ב-ITIM מקיים אינטראקציה עם SHP2. מוטציות ITSM אינן מצליחות לקשור את SHP2, מה שמצביע על כך שהאינטראקציה PD1-SHP2 דורשת ITSM זרחני.

בזמן ביצוע משקעים חיסוניים, יש לבצע את כל השלבים על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השלימו את מאגר הליזיס עם מעכבי פרוטאז על ידי המסת טבליה אחת של המעכבים ב-10 מיליליטר של חיץ. כמו כן, הוסף 1 מילי-מולרית של נתרן אורתוואנדאט למאגר שישמש בלוחות הטרנספטציה PD1-GFP. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח לתאים, הקפד להוסיף את מאגר הליזיס המכיל את הנתרן אורתוונדאט רק לצלחות המכילות תאים שעברו טרנספטציה PD1-GFP.

השתמש במגרד תאים כדי להסיר ולאסוף מיד את התאים מהצלחות. העבירו את הליזטים לצינורות קרים של 1.5 מיליליטר, וסובבו אותם ב -0.005 פעמים גרם וב -4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי לאסוף את הסופרנטנט שלאחר הגרעינים מהליזטים, סובבו אותם בטמפרטורה של 10,000 פעמים גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים והשליכו את הגלולה. אחסן את הסופרנטנטים עבור הסט השני של שש צלחות על קרח, לניתוח WCL מאוחר יותר.

כדי להתחיל בהכנת חרוזים נגד GFP, יש לנער בעדינות את הבקבוק המכיל את החרוזים לפני הפתיחה כדי למנוע שקיעה. הסר 40 מיקרוליטר של חרוזי האנטי-GFP מהתרחיץ לכל תנאי. צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הסר את חומר העל כדי לשטוף את החרוזים, הקפד למזער את המגע בין הפיפטה לחרוזים כדי למנוע אובדן.

השעו מחדש את החרוזים ב-80 מיקרוליטר של מאגר ליזה לדגימה. הוסף את החרוזים השטופים ישירות לליזאט התא מהתאים המבטאים PD1-GFP של הסט הראשון של ארבע הצלחות. סובב ב-0.005 פעמים גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לזרז את החלבונים המתויגים ב-GFP. שטפו את החרוזים שלוש פעמים באמצעות 1 מיליליטר של מאגר ליזה קר שאינו מכיל אורתוואנדאט לכל שטיפה. לאחר מכן, צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 פעמים גרם למשך 10 שניות.

חלקו את הליזאט של ה-SHP2 הפעיל ממערכת הצלחות הראשונה לשלושה חלקים שווים, והוסיפו חלק לכל אחד משלושת הצינורות המכילים את החרוזים המכילים PD1-GFP השטופים. הוסף 1/3 מנפח הליזאט מהתאים הלא מועברים לצינור השני של חרוזי PD1-GFP מסוג בר. השליכו את 2/3 הנותרים.

דגרו את החרוזים למשך 4 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין ב 0.005 פעמים גרם. לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעמיים, בעזרת 1 מיליליטר של מאגר ליזה קר לכל שטיפה. הוסף 80 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל דגימה, וודא שהנפח הכולל בכל צינור הוא 100 מיקרוליטר. בעזרת קצה פיפטה חתוך, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה לערבוב. לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר מכל צינור לשני צינורות טריים של 1.5 מיליליטר.

ראשית, סובבו את החרוזים בטמפרטורה של 2,000 פעמים גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות והסירו את הסופרנטנט. מוסיפים 20 מיקרוליטר של 2x Laemmli buffer, ומרתיחים בחום של 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בעזרת ערכת BCA, מדדו את ריכוז החלבון של בקרות הקלט.

העבירו 30 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת ביותר לצינור חדש. השתמש במאגר ליזה כדי לדלל את שאר בקרות הקלט לאותו ריכוז כמו הדגימה המדוללת ביותר. לאחר מכן, העבירו 30 מיקרוליטר מכל אחד מפקדי הקלט המדוללים לצינור חדש. מוסיפים נפחים שווים של 2x Laemmli buffer לליזטים, ומרתיחים אותם בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, סובב את החרוזים ב-2,000 פעמים g ו-4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לפני ביצוע ניתוח כתמים מערביים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.