בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

מוות מתוכנת-1, PD-1, חלבון קולטן פני התא, מכיל שני מוטיבים של טירוזין ציטופלזמי - המוטיב המעכב, ITIM, ומוטיב המתג, ITSM. קשירת ליגנד גורמת לזרחון ITIM ו-ITSM וגיוס חלבון טירוזין פוספטאז SHP2 לתחום הציטופלזמי של PD-1, מה שמפעיל מפל איתות במורד הזרם.

כדי לחקור אינטראקציות SHP2-PD-1 באמצעות בדיקת קו-אימונו-משקעים, השג תרבית תאי אפיתל דביקה. תאים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק, PD-1 מסוג פרא מתויג GFP עם ITIM ו-ITSM זרחניים. השג תאי אפיתל המבטאים מוטציה PD-1 מתויגת GFP, שבה מוטציות ITIM או ITSM מעכבות את הזרחן שלהם.

הוסף מאגר ליזה המכיל חומר ניקוי ונתרן אורתוונדאט. חומרי הניקוי מפרקים את התאים, וגורמים לשחרור חלבון PD-1 מתויג GFP. חסימות נתרן אורתוואנדאט שחררו פוספטאזים, ובכך מנעו דה-פוספורילציה של ITIM ו-ITSM.

צנטריפוגה הליזאט. העבירו את הסופרנטנט המכיל חלבון לצינורות טריים. הוסף חרוזי אגרוז מצופים נוגדנים נגד GFP. חלבוני ה-PD-1 המתויגים ב-GFP נקשרים לנוגדנים נגד GFP.

דגירה עם מתלה SHP2. ה-PD-1-GFP הקשור בחרוזים קושר את SHP2 באמצעות ה-ITIM וה-ITSM הזרחניים.

הוסף את מאגר Laemmli והרתיח כך שחומרי ההפחתה וחומרי הניקוי במאגר יפגעו במתחמי החלבון PD-1-GFP-SHP2. צנטריפוגה ולאסוף את הסופרנטנט המכיל את קומפלקסי החלבון המפורקים. בצע SDS-PAGE וכתם מערבי.

PD-1 מסוג פרא ומוטציה ב-ITIM מקיים אינ