אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:15 דק׳ • July 8th, 2025
בתאים, חלבונים נקשרים לחלבונים המקיימים אינטראקציה באמצעות רצפים ספציפיים במבנה שלהם - ומווסתים את תפקוד החלבון התוך תאי.
כדי לזהות אינטראקציות חלבון תוך תאיות, קח תרבית תאים דביקה. שאפו את המדיום.
הוסיפו פפטיד חודר תאים ביוטיניל, תמיסת BCPP ודגרו.
כל BCPP מכיל רצף פפטידים המסייע בקישור ספציפי לחלבון התוך תאי הממוקד. לפפטיד יש פפטיד חודר תאים, CPP, בקצה ה-N של הפפטיד וביוטין בקצה C לזיהוי קל.
במהלך הדגירה, אזור ה-CPP הטעון חיובית מקל על כניסת פפטיד קשור דרך קרום התא, ומגיע לציטופלזמה. הפפטיד נקשר לשותף החלבון האינטראקטיבי התוך-תאי שלו - ויוצר קומפלקס חלבון ממוקד BCPP.
הוסף מאגר המכיל מולקולות דטרגנטים הקורעות את קרום התא ומשחררות קומפלקסים של חלבון מטרה BCPP ורכיבים תאיים אחרים.
הוסיפו תמיסה של אבידין הקשור לחרוזי אגרוז - גליקופרוטאין שנקשר באופן ספציפי לביוטין ב-BCPPs. דגירה, המאפשרת קשירה בלתי הפיכה של אבידין לביוטין ומטהרת קומפלקסים של חלבוני מטרה של אבידין-BCPP.
צנטריפוגה לכדור החרוזים. השעו מחדש את החרוזים במאגר כדי לבקע קשרים לא קוולנטיים בין החלבונים ולסלק קומפלקסים של חלבון CPP-פפטיד מחרוזי הביוטין-אבידין.
נתח את קומפלקסי CPP-פפטיד-חלבון על ידי כתמים מערביים. פס משקל מולקולרי גבוה יותר עבור קומפלקס CPP-פפטיד-חלבון ממרכיבי הקומפלקס מצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שותפי החלבון האינטראקציה.
הוסף את נפח תמיסת המלאי של BCPP לתרביות התאים כדי להגיע לריכוז שהוכח כיעיל.
לכן, הוסף 92.8 מיקרוליטר של 2 מיליגרם למיליליטר של TAT-Connexin-43266-283-ביוטין למיליליטר של מדיום תרבית. מקמו את התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות, כדי לוודא שהאינטראקציות בין ה-BCPP לשותפיו התוך-תאיים מתרחשות.
כדי לבצע את מיצוי החלבון, ראשית, שאפו את מדיום התרבות לחלוטין. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר של מי מלח קרים כקרח עם פוספט לכל 150 סנטימטרים, בזהירות רבה כדי למנוע ניתוק תאים.
כדי להשיג את ליזאט התא, הוסף 3 מיליליטר של מאגר ליזה לכל בקבוק של 150 סנטימטר מרובע, וגרד היטב את פני השטח באמצעות מגרד תאים. הטיית הבקבוק לכ- 45 מעלות תקל על איסוף הליזטים של התאים לצינורות המתאימים להם.
יוצקים 1 מיליליטר של הליזאט הסלולרי לכל שפופרת לתוך 3 צינורות של 1.5 מיליליטר המסומנים לפי מצב. לצורך המשיכה, צנטריפוגה את צינורות ה-1.5 מיליליטר ב-11,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
העבירו את הסופרנטנטים למבחנות חדשות שמסומנות ב-A. העבירו מנה של הסופרנטנט לכל מצב למבחנות שונות שמסומנות ב-B. לאחר מכן, הוסף 16.6 מיקרוליטר של מאגר Laemmli 4x עבור 50 מיקרוליטר ליזאט והקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הומוגניזציה של אגרוז NeutrAvidin היטב על ידי ניעור עדין.
חותכים את קצות קצות הפיפטה כדי להגדיל את קוטרם ולשפר את פיפטינג החרוזים. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של NeutrAvidin agarose לכל מיליליטר של ליזאט תאים בצינורות A. דגרו את התא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ניעור עדין מאוד כדי לאפשר ל-NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs הקשורים לשותפיהם התוך-תאיים.
לאחר מכן, צנטריפוגה ב-3,000 פעמים גרם למשך דקה אחת ב-4% מעלות צלזיוס כדי לאסוף את הקומפלקס של NeutrAvidin עם חלבונים. הסר בזהירות את חומרי העל, והעביר אותם לצינורות נקיים המסומנים C. שמור אותם לשימוש למקרה שהמשיכה לא תצליח.
כדי לשטוף את הקומפלקס של NeutrAvidin בחלבונים, הוסף מאגר ליזה טרי לכדורי צינורות A. השעו מחדש את הגלולה על ידי היפוך, וחזרו על הצנטריפוגה. חזור על הכביסה הזו חמש פעמים נוספות. ניתן להשליך את כל הסופרנטנטים הללו.
לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של 2x Laemmli buffer לכל צינור של 1.5 מיליליטר עבור כדורים המתקבלים מ-150 סנטימטר רבוע של תאים מתלכדים. לאחר מכן, יש לשטוף ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנתק את האינטראקציות בין החלבונים.
לאחר הפליטה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-8,200 פעמים גרם כדי לגלול חרוזי NeutrAvidin. העבירו את הסופרנטנטים שמכילים את החלבונים המנותקים עם קצות נימיים לצינורות חדשים שמסומנים D.
סופרנטנטים אלה מוכנים כעת להעמסה בכתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, או שניתן להקפיא אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.