בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

בתאים, חלבונים נקשרים לחלבונים המקיימים אינטראקציה באמצעות רצפים ספציפיים במבנה שלהם - ומווסתים את תפקוד החלבון התוך תאי.

כדי לזהות אינטראקציות חלבון תוך תאיות, קח תרבית תאים דביקה. שאפו את המדיום.

הוסיפו פפטיד חודר תאים ביוטיניל, תמיסת BCPP ודגרו.

כל BCPP מכיל רצף פפטידים המסייע בקישור ספציפי לחלבון התוך תאי הממוקד. לפפטיד יש פפטיד חודר תאים, CPP, בקצה ה-N של הפפטיד וביוטין בקצה C לזיהוי קל.

במהלך הדגירה, אזור ה-CPP הטעון חיובית מקל על כניסת פפטיד קשור דרך קרום התא, ומגיע לציטופלזמה. הפפטיד נקשר לשותף החלבון האינטראקטיבי התוך-תאי שלו - ויוצר קומפלקס חלבון ממוקד BCPP.

הוסף מאגר המכיל מולקולות דטרגנטים הקורעות את קרום התא ומשחררות קומפלקסים של חלבון מטרה BCPP ורכיבים תאיים אחרים.

הוסיפו תמיסה של אבידין הקשור לחרוזי אגרוז - גליקופרוטאין שנקשר באופן ספציפי לביוטין ב-BCPPs. דגירה, המאפשרת קשירה בלתי הפיכה של אבידין לביוטין ומטהרת קומפלקסים של חלבוני מטרה של אבידין-BCPP.

צנטריפוגה לכדור החרוזים. השעו מחדש את החרוזים במאגר כדי לבקע קשרים לא קוולנטיים בין החלבונים ולסלק קומפלקסים של חלבון CPP-פפטיד מחרוזי הביוטין-אבידין.

נתח את קומפלקסי CPP-פפטיד-חלבון על ידי כתמים מערביים. פס משקל מולקולרי גבוה יותר עבור קומפלקס CPP-פפטיד-חלבון ממרכיבי הקומפלקס מצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שותפי החלבון