בדיקת שמרים דו-היברידית לקביעת הקשר העצמי של חלבונים בתאי שמרים

לבדיקת שני היברידיים של שמרים, קח תרחיף תאי שמרים מהונדס גנטית, הגדל באופן פעיל וחסר את חלבון מפעיל השעתוק, GAL4. תאים אלה אינם יכולים לסנתז לאוצין וטריפטופן.

הוסף זוג פלסמידים לביטוי: האחד מקודד לאוצין ותחום קשירת ה-DNA, DNA-BD, של GAL4, מאוחה לתחום חלבון מטרה, והשני מקודד טריפטופן ותחום המפעיל, AD, של GAL4 התמזג לתחום אחר של חלבון המטרה.

הוסף מאגר המכיל סוכנים מתאימים לטרנספורמציה. הלם חום של התאים כדי לגרום להיווצרות נקבוביות חולפת, מה שמקל על ספיגת הפלסמיד התאי. מצננים כדי לאטום מחדש את הנקבוביות. צלחת את התאים על מצע גידול סלקטיבי חסר לאוצין וטריפטופן.

התאים שעברו טרנספורמציה המבטאים שני חלבונים היברידיים מסנתזים לאוצין וטריפטופן, שורדים ויוצרים מושבות.

ה-DNA-BD שהתמזג לתחום חלבון נקשר לרצף ה-DNA הספציפי במעלה הזרם של אזור מקדם הגנים המקודד β-גלקטוזידאז. אם תחומי חלבון המטרה מתקשרים, ה-AD וה-DNA-BD מתקרבים, וגורמים לבנייה מחדש של GAL4 פונקציונלי, מה שמוביל לביטוי של גן β-גלקטוזידאז.

העבירו את המושבות על נייר סינון. הקפיאו-הפשירו את התאים כדי לשחרר אותם ולשחרר β-גלקטוזידאז. הנח נייר סינון זה על נייר סינון אחר ספוג במצע β-גלקטוזידאז.

ה-β-galactosidase המשוחרר מבצע הידרוליזה של המצע לגלקטוז ולמוצר לא יציב, אשר מתעמעם ומתחמצן ויוצר משקע כחול על נייר המסנן, המעיד על אינטראקציה בתחו