אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:34 דק׳ • July 8th, 2025
טיהור זיקה טנדם הוא תוכנית טיהור רציפה לבידוד קומפלקסים של חלבון מהתאים כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון.
כדי להתחיל, קחו תרבית תאים המבטאת חלבונים מתויגים באפיטופים מעניינים. החלבונים יוצרים קומפלקס בתוך התא. אחד החלבונים בקומפלקס מכיל תג סטרפטוק, בעוד שהשני מסומן בתג FLAG. אלו הם תגי זיקה קטנים מבוססי רצף פפטידים סינתטיים.
הסר את המדיום והוסף תמיסת חומר ניקוי כדי לליז את התאים. צנטריפוגה להסרת הפסולת התאית. אספו את הסופרנטנט המכיל את קומפלקס חלבון המטרה וחלבונים תאיים אחרים.
הוסיפו חרוזי סטרפטוקוקוס - חרוזי אגרוז מצופים בסטרפטווידין - ודגרו. תג הסטרפטוקוקוס של קומפלקס החלבון נקשר לסטרפטווידין. צנטריפוגה לאיסוף החרוזים הקשורים לקומפלקס החלבון. שטפו כדי להסיר חלבונים תאיים מזהמים.
הוסף חוצץ פליטה המכיל דסטיוביוטין - נגזרת של ביוטין - שמחליף את קומפלקס החלבון על ידי קשירה תחרותית לסטרפטווידין. צנטריפוגה כדי להשיג סופרנטנט המכיל את קומפלקס החלבון המנופח.
הוסיפו חרוזי FLAG - חרוזי אגרוז המצופים בנוגדנים נגד FLAG - ודגרו. תג ה-FLAG של קומפלקס החלבון נקשר לנוגדן. צנטריפוגה לאיסוף החרוזים הקשורים לקומפלקס החלבון.
הוסף מאגר פליטה המכיל פפטיד FLAG חופשי. הפפטיד נקשר באופן תחרותי לנוגדנים ומחליף את קומפלקס החלבון הקשור צנטריפוגה כדי לסלק את קומפלקס החלבון המטוהר.
הערך את נוכחותם של שני החל
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים