בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

טיהור זיקה טנדם הוא תוכנית טיהור רציפה לבידוד קומפלקסים של חלבון מהתאים כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון.

כדי להתחיל, קחו תרבית תאים המבטאת חלבונים מתויגים באפיטופים מעניינים. החלבונים יוצרים קומפלקס בתוך התא. אחד החלבונים בקומפלקס מכיל תג סטרפטוק, בעוד שהשני מסומן בתג FLAG. אלו הם תגי זיקה קטנים מבוססי רצף פפטידים סינתטיים.

הסר את המדיום והוסף תמיסת חומר ניקוי כדי לליז את התאים. צנטריפוגה להסרת הפסולת התאית. אספו את הסופרנטנט המכיל את קומפלקס חלבון המטרה וחלבונים תאיים אחרים.

הוסיפו חרוזי סטרפטוקוקוס - חרוזי אגרוז מצופים בסטרפטווידין - ודגרו. תג הסטרפטוקוקוס של קומפלקס החלבון נקשר לסטרפטווידין. צנטריפוגה לאיסוף החרוזים הקשורים לקומפלקס החלבון. שטפו כדי להסיר חלבונים תאיים מזהמים.

הוסף חוצץ פליטה המכיל דסטיוביוטין - נגזרת של ביוטין - שמחליף את קומפלקס החלבון על ידי קשירה תחרותית לסטרפטווידין. צנטריפוגה כדי להשיג סופרנטנט המכיל את קומפלקס החלבון המנופח.

הוסיפו חרוזי FLAG - חרוזי אגרוז המצופים בנוגדנים נגד FLAG - ודגרו. תג ה-FLAG של קומפלקס החלבון נקשר לנוגדן. צנטריפוגה לאיסוף החרוזים הקשורים לקומפלקס החלבון.

הוסף מאגר פליטה המכיל פפטיד FLAG חופשי. הפפטיד נקשר באופן תחרותי לנוגדנים ומחליף את קומפלקס החלבון הקשור צנטריפוגה כדי לסלק את קומפלקס החלבון המטוהר.

הערך את נוכחותם של שני החלבונים באלוט כדי לאשר את האינטראקציה בין החלבונים המעניינים.

לאחר שתערובות הליזאט של התא ותערובות חרוזי STREP דגרו במשך שעתיים, סובבו אותן ב-1,1500 פעמים גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שמרו את הסופרנטנט כ-"STREP AP flow-through", ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס.

הוסף 500 מיקרוליטר של STREP AP Wash Buffer 1 לחרוזים. אגוזים את תערובת החרוזים והחיץ למשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס, וצנטריפוגה בחום של 1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant ושטפו שוב עם 500 מיקרוליטר של STREP AP Wash Buffer 1.

לאחר הכביסה השלישית, העבירו את תמיסת החרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר כדי להפחית את רקע החלבון. יש לכבס פעם רביעית עם STREP AP Wash Buffer 1. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר של Wash Buffer 2.

אזנו את החרוזים על ידי היפוך הצינורות, ולאחר מכן, סובבו כלפי מטה ב-1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. הסר את החלבון המעניין עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטת STREP. מערבולת ב-800 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. סובב את החרוזים ב 1500 פעמים גרם למשך דקה אחת ב -4 מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט. שבר זה תואם את דגימת "שטיפת STREP AP".

שמור את שבר החרוזים ב -4 מעלות צלזיוס לפליטה שנייה. מכסים 10% מפליטת STREP AP לצביעת כסף ו/או כתמים מערביים.

כדי להגדיל את כמות חומר ההתחלה עבור המשקעים החיסוניים של FLAG שלאחר מכן, ניתן לאגד יחד את פליטות ה-STREP הראשון והשני לשחזור יעיל יותר של פליטת ה-FLAG.

התחל הליך זה על ידי שימוש בקצה פיפטה רחב פה כדי להעביר את הכמות המתאימה של תמיסת חרוז FLAG לצינור מיקרוצנטריפוגה. סובב ב-1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר של FLAG Wash Buffer לחרוזים.

סובב ב-1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב עם מאגר כביסה FLAG. לאחר הכביסה השלישית, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החרוזים במאגר הכביסה של FLAG לנפח סופי של n כפול 16 מיקרוליטר כאשר n הוא מספר הדגימות.

הוסף 16 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי FLAG לפליטת ה-STREP AP הנותרת, ואגוז למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של לילה של תמיסת חרוזי FLAG ופליטת STREP AP, המשך עם משקעים חיסוניים של FLAG.

סובב את מתלה חרוזי ה-FLAG ב-1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שמור את הסופרנטנט כ-"FLAG IP flow-through", ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG לחרוזים. אגוזים במשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס, וצנטריפוגה בחום של 1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG.

לאחר הכביסה השלישית, העבירו את תמיסת חרוז החלבון לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר כדי להפחית את הרקע. שטפו פעם רביעית עם מאגר כביסה FLAG. הסר את הסופרנטנט מהסיבוב הסופי, והוסף לחרוזים 30 מיקרוליטר של מאגר כביסה FLAG המכיל 200 ננוגרם למיקרוליטר של פפטיד FLAG. מערבולת ב-800 סל"ד למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר שעתיים, סובב את המתלה ב -1,500 פעמים גרם למשך 2 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. קצרו את הסופרנטנט, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כ"פליטת FLAG IP".