JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:05 דק' • July 8th, 2025
ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית, או NMR, מאפשרת זיהוי אינטראקציה בין חלבון לחלבון ברמה האטומית.
כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים כדוריים וסליליים, סמן חלבונים כדוריים מטוהרים מסוג בר או מוטנטי עם 15N - איזוטופ חנקן. בצינור NMR, מערבבים את החלבונים הכדוריים והסליליים המסומנים בממס המכיל תקן NMR. הכנס את הצינור לספקטרומטר NMR.
המגנטים של הספקטרומטר מייצרים שדה מגנטי חזק, ומיישרים את 15גרעיני החלבון הכדורי המסומנים ב-N במקביל לשדה. פולס בתדר רדיו, או RF, מעורר את 15גרעיני ה-N כדי ליישר אנטי-מקביל לשדה.
תדר הפולס הנדרש למעבר של 15N גרעינים בין שני המצבים מגדיר את תדר התהודה. נורמליזציה של תדר תהודה של 15N לתקן NMR מודדת את השינוי הכימי של 15N.
השדה המגנטי מותאם כדי ליישר את גרעיני ה-H 1- הקשורים ל-15N - במקביל לשדה. פולסי ה-RF מותאמים, וההסטה הכימית של 1H נרשמת.
במהלך אינטראקציות חלבון, הסביבה הכימית המקיפה את שאריות חומצות האמינו האינטראקטיביות משתנה, ומשנה את הקשרים הכימיים של 15 N-1H ואת התזוזות הכימיות המתאימות. שרטט את ספקטרום 15 N-1H NMR.
ללא חלבונים סליליים, חלבונים כדוריים מסוג בר מציגים פסגות ספקטרליות פתורות היטב. כאשר חלבונים כדוריים סליליים ופראיים מתקשרים, השיא הספקטרלי מצטמצם. לעומת זאת, דגירה של חלבונים סליליים עם חלבונים כדוריים מוטנטיים מביאה להופעת הפסגות הספקטרליות מחדש, מה שמעיד על כך שאין אינטראקציה ביניהם.
הפעל את זרימת האוויר באמצעות פקודת ההוצאה "ej". זה יעלה את הדגימה מהמגנט. כעת, הנח את הדגימה בתוך ספינר על גבי המגנט בפתח. הוספה עם הפקודה "ij". המתן עד שהדגימה תתייצב בתוך המגנט לפני שתמשיך.
צור מערך נתונים חדש באמצעות הפקודה "edc", וטען פרמטרים סטנדרטיים של Proton NMR על ידי בחירת הניסוי "ZGPR". מלא את שדות השם, מספר הניסוי ומספר תיקיית הנתונים המעובדים.
בחר את הממס בשדה "הגדר ממס" ולחץ על "בצע 'getprosol'" כדי לקרוא את ראש הבדיקה הסטנדרטי ופרמטרים תלויי ממס. נעל את הדגימה לממס המנותק באמצעות הפקודה "נעילה", והמתן עד שתסיים לטאטא ותשיג נעילה.
תקן את תדר התהודה של המגנט על ידי כוונון הדגימה באמצעות פקודת הכוונון האוטומטי "atma". עקוב אחר עקומת הנדנוד עד להשלמת הכוונון האוטומטי.
שים את השדה המגנטי באמצעות "TOPSHIM". Shimming מבצע התאמה לשדה המגנטי כדי להשיג אחידות סביב הדגימה. מומלץ לאחסן את אותם ערכים עם הפקודה "wsh" ולקרוא אותם באמצעות "rsh" לפני topshim אם משתמשים בדוגמאות זהות או דומות.
כעת, כוונן את רווח המקלט באמצעות הפקודה "rga" כדי להשיג את יחס האות לרעש המרבי. הנח את מרכז הספקטרום על היסט תהודת המים והגדר את דופק הפרוטונים של 90 מעלות בעוצמה גבוהה באמצעות "calibo1p1".
אסוף את ספקטרום הפרוטונים באמצעות הפקודה Zero Go "zg" ועבד עם "efp". זה כולל כפל אקספוננציאלי, דעיכת האינדוקציה החופשית המשלבת הרחבת קו, טרנספורמציה פורייה של FID ו-"pk" להחלת תיקון פאזה.
החל את תיקון הפאזה האוטומטי "apk" ואת תיקון הבסיס האוטומטי "absn" באמצעות אפשרות הפולינום ללא אינטגרציה. צור מערך נתונים חדש עבור ניסוי SOFAST HMBC על ידי בחירת "SFHMQC3GPPH" בניסוי.
העתק את ה-P1 וה-O1 האופטימליים מספקטרום הפרוטונים ואכלס פולסים תלויי P1 באמצעות הפקודה "getprosol 1H p1 plw1" כאשר P1 הוא ערך ה-P1 האופטימלי ו-plw1 היא רמת ההספק עבור P1. כעת, בצע אופטימיזציה של קבוע CNST54 כדי להגדיר את ההיסט להסטה כימית של אמיד. כמו כן, בצע אופטימיזציה של CNST55 כדי להגדיר את רוחב הפס על מנת להקיף את אזורי העניין הספקטרליים, ולאפשר אופטימיזציה של רווח המקלט.
כדי לבחור פרמטרים אלה, חלץ את ה-FID הראשון מהספקטרום הדו-ממדי, וחפש את האות הנצפה כדי להגדיר אותם. בנוסף, שנה את עיכוב ההרפיה, מספר הסריקות וסריקות הדמה כדי להשיג רגישות אות מקובלת עם הפקודה "gs", המאפשרת go and scan כדי לנטר את איכות הנתונים בזמן אמת. לבסוף, רשום את הספקטרום באמצעות Zero Go "zg".