שימוש בתצוגת פאגים לבחירת חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון מטרה

התחל את תצוגת הפאג'ים על ידי הוספת ספריית פאג'ים לבארות של צלחת מרובת בארות, מצופה בחלבון מטרה. ספריית הפאג'ים מכילה פאג'ים מהונדסים גנטית, שכל אחד מהם מציג וריאנט חלבון בודד המותך לחלבון מעטפת על פני השטח שלו. דגירה, מה שמאפשר לפאג' ולחלבוני המטרה לקיים אינטראקציה.

פאג'ים עם חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון יעד נקשרים לחלבון המטרה. שוטפים עם חיץ, מסירים פאג'ים לא קשורים. הוסף תמיסה חומצית, משבש את האינטראקציות של הפאג'ים וחלבון היעד, ומשחרר פאג'ים לתמיסה. לנטרל את ה-pH של התמיסה באמצעות חיץ, תוך שמירה על יציבות הפאג'ים.

העבירו את הפאג'ים לצינור טרי. דגירה עם תמיסה חוסמת המכילה חלבונים, המונעת אינטראקציות לא ספציפיות.

העבירו את הפאג'ים לתרחיף E. coli המתחלק באופן פעיל, מדביקים חיידקים ומתחילים את מחזור שכפול הפאג'ים. תוסף עם פאג'ים עוזרים, המדביקים את החיידקים, ומספקים חלבוני פרווה הדרושים לאריזת הפאג'ים הצאצאים. העבירו את התרחיף למדיום סלקטיבי, המאפשר צמיחת חיידקים נגועים בפאג'ים.

הפאג'ים הצאצאים משתחררים בסופו של דבר לתווך. צנטריפוגה. אסוף את הסופרנטנט המכיל פאג'ים. הוסף תמיסת משקעים, תוך ריכוז חלקיקי הפאג'. צנטריפוגה. השעו מחדש את כדור הפאג 'במאגר, וקבלו מתלה הומוגני.

בצע סבבי בחירת פאג'ים עוקבים; חזור על קשירת חלבון יעד הפאג'ים, פליטה עם שלב מחמיר מוגבר של שטיפת חיץ, ושלבי הגברה וצנטריפוגה, וכתוצאה מכך העשרה של מאגרי פאג'ים המציגים חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון המטרה.

הפשירו את ספריית הפאג'ים על קרח. לאחר מכן, לדלל אותו פי 100 ממגוון הספריות ב-PBS. הוסף את תמיסת הפוליאתילן גליקול/נתרן כלורי ב-1/5 מנפח הספרייה המדולל, ודגר את התמיסה על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה ב -11,000 פעמים גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, וצנטריפוגו אותו למשך שתי דקות נוספות כדי למשוך את הסופרנטנט שנותר למטה ולרכז את כדור הפאג'.

השעו מחדש בעדינות את גלולת הפאג'ים במיליליטר אחד של מאגר PBT לכל חלבון מטרה לניתוח, בדרך כלל, ארבעה בסך הכל. הוסף 100 מיקרוליטר של ספריית פאג'ים לכל באר מצופה בלוחית הבקרה. דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול מסלול של 300 סל"ד.

השלך את מאגר ה-PB מלוחית המטרה לכיור, וייבש את הצלחת על מגבות נייר. העבר את כל 100 המיקרוליטר של ספריית הפאג'ים בלוחית הבקרה לכל באר מצופה של לוחית המטרה. דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול מסלול של 300 סל"ד.

לאחר מכן, הסר את ספריית הפאג'ים מהצלחת, ושטוף את הבארות המצופות ארבע פעמים עם מאגר PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את טיפות החיץ האחרונות. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.1 חומצה הידרוכלורית מולרית לכל באר מצופה כדי לחסל את הפאג'. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות עם טלטול מסלולי של 300 סל"ד.

לאחר מכן, נטרל את ה-pH על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטר של pH 11 טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת לכל באר מצופה. העבירו את הפאג' המנומק מכל שמונה הבארות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר. פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך את התמיסות להומוגניות, ולשאוב את כל הנוזלים מהבארות. הוסף 10% BSA לפאג' המנוטרל כדי להפוך את הריכוז הסופי ל-1%.

אחסן את צינור המיקרו-צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. זהו הפלט של הסיבוב הראשון. הכן תרבית זרעים לתרבית קלט הפאג'ים לסבב הבחירה הבא על ידי חיסון חמישה מיליליטר של תרבית זרעי 2YT/טטרציקלין עם מושבת E. coli מבודדת מצלחת אגר.

דגרו אותו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות של 200 סל"ד. יש לדלל את חלבון המטרה בצינור הסיבוב השני והשלישי בכמות מתאימה של PBS. קח מחצית מתכולת הסיבוב השני והשלישי וצפה ארבע בארות לכל חלבון מטרה בצלחת קשירה של 96 בארות לסיבוב הבא.

לאחר מכן, השתמש במחצית מהפלט העגול הראשון כדי לחסן שלושה מיליליטר של תאי שלב אמצע לוג. דגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם טלטול מסלול של 200 סל"ד. הוסף M13KO7 Helper Phage לריכוז סופי של 10 מיליארד pfu למיליליטר. דגרו אותו שוב ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם רעידות מסלוליות של 200 סל"ד.

לאחר שעה, העבירו את כל שלושת המיליליטר של התרבית ל-30 מיליליטר של תמיסת 2YT/קרבניצילין/קנמיצין. גדל בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות של 200 סל"ד.