משקעים חיסוניים של כרומטין לזיהוי אתרי קישור חלבוני מטרה בדנ"א גנומי

כדי לזהות את אתרי הקישור של חלבון מטרה ב-DNA, התחל עם תאי מבשר אוליגודנדרוציטים המכילים חלבון מטרה המקושר לרצפי DNA ספציפיים בכרומטין.

טפל בתאים באמצעות מאגר ליזה המכיל מעכבי פרוטאז. מאגר הליזיס מבצע ליזה של התאים, בעוד שהמעכבים משביתים פרוטאזות כדי לשמור על שלמות קומפלקסי החלבון-כרומטין.

סוניקציה של התוכן כדי לגזור את הקומפלקסים לשברי כרומטין קטנים יותר, כאשר חלקם שומרים על חלבון המטרה.

צנטריפוגה כדי לגלול את רכיבי התא, ולהעביר את הסופרנטנט המכיל שברי כרומטין לתוך צינור טרי. דגירה עם נוגדנים נגד מטרה הנקשרים באופן ספציפי לחלבון המטרה על שברי הכרומטין.

השלם את הצינור עם חרוזים מגנטיים מצופים חלבון A הנקשרים לאזור Fc של נוגדנים קשורים מראש. הפעל שדה מגנטי כדי לזרז באופן סלקטיבי את חלבוני המטרה הקשורים לנוגדנים המורכבים עם שברי כרומטין.

טפל במתחמי החרוזים עם מאגר פליטה גבוה המכיל מלח כדי לשבש את אינטראקציות החלבון-כרומטין ולשחרר את ה-DNA העירום ללא חלבונים קשורים.

השתמש בממיסים אורגניים כדי לחלץ את ה-DNA. הוסף מאגר הגברה, והפעל תגובת שרשרת פולימראז כדי להגביר את שברי ה-DNA. לאחר הגברה, נתח את רצף ה- DNA.

השווה את רצף התוצרים המוגברים לרצף ה-DNA הגנומי של התא. מצא את האזור עם התאמת רצף בין המקטע ל-DNA הגנומי - בקורלציה עם אתרי קשירת החלבון.

לאחר ספירה בהמוציטומטר, הוסף 20,000 OPCs מטוהרים ב-1 מיליליטר של מדיום תרבית תאי OPC לתגובת ChIP. לאחר מכן, הוסף 27 מיקרוליטר של 36.5% פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. פעולה זו תתקן את התאים.

לאחר 10 דקות, הוסף 50 מיקרוליטר של 2.5 גליצין מולארי על התאים הקבועים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוספת הגליצין תפסיק את הצלבת ה-DNA-חלבון. לאחר מכן, שטפו את התאים הצולבים עם 1 מיליליטר של מאגר HBSS עם קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים במכונת צנטריפוגה מקוררת מראש ב -300 פעמים גרם ב -4 מעלות צלזיוס.

לאחר קישור צולב של ה-OPCs המטוהרים, יש לשטוף את התאים הצולבים באמצעות תמיסת HBSS קרה כקרח, ולבצע את שאר שלבי ה-ChIP ב-4 מעלות. אחרת, הנוגדן לא יכול לזרז את ה-DNA הגנומי כראוי.

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר ליזה שלם לכדור התא והשאיר על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, פיפטה 75 מיקרוליטר של מאגר HBSS קר כקרח עם קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, גזור את הכרומטין של ליזאט התא במערכת סוניקציה מקוררת מראש עם חמישה מחזורים של תוכנית ON של 30 שניות ו-30 שניות OFF.

לאחר גזירת הכרומטין, צנטריפוגה את התא ליזאט ב-14,000 פעמים גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בסוף הצנטריפוגה, אוספים את הסופרנטנט. לאחר מכן, יש לדלל 100 מיקרוליטר מהכרומטין הגזוז בנפח שווה של מאגר ChIP קר כקרח עם מעכב פרוטאז.

לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן Rabbit anti-olig2 ל-180 מיקרוליטר של הכרומטין הגזוז המדולל. דגרו את הצינורות על גלגל מסתובב למשך 16 שעות ב-4 מעלות צלזיוס ב-40 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מצופים חלבון A שטופים מראש לצינור התגובה ChIP בחדר קירור. שוב, דגרו את צינורות ה-ChIP ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות על הגלגל המסתובב.

לאחר שעתיים, השאר את צינור התגובה ChIP על המדף המגנטי למשך דקה. לאחר מכן, שטפו את כדור החרוזים עם 100 מיקרוליטר של ארבעה מאגרי כביסה כל אחד למשך 4 דקות על גלגל מסתובב ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה לגלולת החרוזים. דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.

לאחר דנטורציה של ה-DNA הדו-גדילי, יש לזרחן את הקצה התלת-ראשוני של ה-DNA החד-גדילי על ידי הוספת פוספטאז אלקליין שרימפס. לאחר מכן, הוסף זנב פולי (T) ל- DNA החד-גדילי באמצעות טרנספראז דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז. לאחר מכן, חישול פריימר ה-DNA poly-(dA) לתבנית ה-DNA החד-גדילית. לאחר מכן, הגדל את ספריית רצפי ה-ChIP באמצעות פריימרים קדימה ואחורה לאינדקס.

מספר מחזורי ה-PCR להכנת הספרייה תלוי בכמות ה-DNA ההתחלתי. הכנת ספרייה טובה דורשת כימות מדויק של כמות ה-DNA הקלט. יותר מדי או מעט מדי מחזורי PCR יכולים להשפיע על ריכוז הספרייה כמו גם על המורכבות, מה שמוביל לחפצי PCR.

השתמש בחרוזים פרמגנטיים כדי לבחור את השברים הנעים בין 250 ל-500 זוגות בסיסים מספריית רצפי ה-ChIP המוגברת ב-PCR. השתמש במכשיר אלקטרופורזה נימי ChIP מיקרופלואידית כדי לבחון את איכות ספריית רצפי ה-ChIP שנבחרה.