אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית לקביעת גורם שעתוק-זיקה לקשירת DNA

גורם שעתוק, TF, הוא חלבון שנקשר לאזור ה-DNA הספציפי של הגן ומווסת את השעתוק.

כדי למדוד אינטראקציות TF-DNA על ידי אניזוטרופיה פלואורסצנטית, קח צלחת מרובת בארות. הוסף לבאר ג'ל מותך מעורבב עם תמיסה חוצצת, המכילה ריכוזים ידועים של DNA ייחוס מתויג פלואורופור הכולל אתר קשירת TF וריכוז גבוה יותר של מולקולות TF, והדגירה.

כאשר ה-DNA הייחוס המסומן מפיץ בג'ל, ריכוז מולקולות TF גבוה יותר מבטיח שכל מולקולות ה-DNA קשורות ל-TF. הוסף תמיסה מאוחסנת המכילה DNA מתחרה ללא תווית עם מוטציה חד-נקודתית.

נתח את הג'ל של הצלחת באמצעות מיקרוסקופ אניזוטרופי פלואורסצנטי בעל ביצועים גבוהים.

אור מקוטב מעורר את הפלואורופור הקשור ל-DNA, אשר מכוון מחדש עקב נפילה מולקולרית ופולט אור דה-פולריזציה רב-כיווני - תופעה הנקראת אניזוטרופיה פלואורסצנטית, FA.

עם הקישור ל-TF, המשקל המולקולרי של הפלואורופור הקשור ל-DNA גדל והוא נופל לאט יותר, ופולט יותר אור מקוטב שמגביר את ה-FA.

ה-DNA המתחרה הלא מסומן מתפזר על פני מטריצת הג'ל לאורך זמן, ויוצר שיפוע ריכוז גבוה עד נמוך. ריכוז DNA מתחרה גבוה יותר ללא תווית עוקר את ה-DNA המסומן, וקושר את עצמו ל-TF. האוליגומרים המתויגים ששוחררו נופלים מהר יותר, ומפחיתים את ה-FA.

שרטטו את ה-FA של הפלואורופור ואת שיפוע הריכוז של ה-DNA המתחרה לאורך זמן - שיורד ככל שמולקולות DNA מתחרות יותר מחליפות את ה-