כתב בדיקת דיכוי גנים לחקר רגולציה תרגומית של גן מטרה

חלבונים קושרי RNA, RBPs, מתפקדים כמווסתים לאחר שעתוק על ידי קשירה לאזור התחלת התרגום, TIR, של mRNA ודיכוי התרגום.

כדי לחקור אינטראקציות RNA-RBP באמצעות דיכוי תרגומי של גן מדווח, קח תרבית תאים חיידקית המכילה שני פלסמידים - אתר הקישור ופלסמידים RBP.

הפלסמיד באתר הקישור מקודד גן מדווח פלואורסצנטי. עם השעתוק, ה-TIR של ה-mRNA המתקבל מכיל אתר קשירת ריבוזום ומבנה סיכת ראש, עם רצף המזוהה על ידי RBPs.

ריבוזומים נקשרים לאתר הקישור ב-mRNA ומערערים את מבנה סיכת הראש, מה שמוביל לתרגום mRNA ולהיווצרות חלבון מדווח פלואורסצנטי. הפלסמיד RBP מבטא RBP כימרי המותך לחלבון פלואורסצנטי אחר. מקדם השראה שולט בביטוי החלבון הכימרי.

הוסף את המשרה המפעיל גורם שעתוק שנקשר למקדם, וגורם לביטוי חלבון כימרי. ה-RBP של החלבון הכימרי נקשר למבנה סיכת הראש. זה חוסם את הריבוזום מלהיקשר ל-mRNA, ומעכב את תרגום החלבון המדווח.

עם הגדלת ריכוז המשרה, ייצור ה-RBP עולה, וכתוצאה מכך עיכוב תחרותי חזק יותר של קשירת ריבוזומלי ל-mRNA.

מדוד את אותות הקרינה השונים מהחלבונים הכימריים והמדווחים. שרטט את האותות, וקבל את עקומת המינון-תגובה.

עם העלייה בתיווך המשרה בייצור RBP, דיכוי תרגומי מפחית את ריכוז החלבון המדווח, ומאשר אינטראקציה של RNA-RBP.

הפוך את הפלסמידים המוכנים לתאי חיידקים מוכשרים כימית שכבר מכילים פלסמיד RBP-mCerulean. כדי לחסוך זמן, צלחת את התאים באמצעות פיפטור בעל 8 תעלות על צלחות בנות 8 נתיבים המכילות אגר לוריא-ברטני עם אנטיביוטיקה רלוונטית. מושבות צריכות להופיע תוך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בחר מושבה אחת לכל טרנספורמנט כפול והעביר לצלחות של 48 בארות המכילות 1.5 מיליליטר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה. גדל את התאים במשך תקופה של 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ורעד ב-250 סל"ד. אחסן את מלאי הגליצרול של הלילה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בצלחות של 96 בארות.

בבוקר, תכנת את הרובוט לחמם 180 מיקרוליטר של מדיום גרוע למחצה, או SPM, בצלחות של 96 בארות. תכנת את הרובוט להכין את לוחית ההשראה.

בצלחת נקייה של 96 בארות, הכינו בארות עם SPM המורכב מ-95% BA ו-5% LB. מספר הבארות תואם את המספר הרצוי של ריכוזי המשרים. הוסף C4-HSL לבארות בצלחת המשרה שתכיל את ריכוז המשרה הגבוה ביותר.

לאחר מכן, תכנת את הרובוט לדלל באופן סדרתי מדיום מכל אחת מבארות הריכוז הגבוהות ביותר ל-23 ריכוזים נמוכים יותר הנעים בין 0 ל-218 ננו-מולארי. הנפח של כל דילול משרה צריך להספיק לכל הזנים.

כדי לדלל את זני הלילה, תכנת את הרובוט לדלל בפקטור של 10 על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר חיידקים עם 180 מיקרוליטר SPM בצלחות של 48 בארות. לאחר מכן, יש לדלל שוב בפקטור של 10 על ידי לקיחת 20 מיקרוליטר מהתמיסה המדוללת לתוך לוחית המתח שהוכנה מראש המתאימה למדידות פלורסנט.

כעת, תכנת את הרובוט להוסיף את המשרה המדולל מלוח המשרה לצלחות 96 הבארות עם הזנים המדוללים בהתאם לריכוזים הסופיים. מנערים את צלחות 96 הבארות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות. במהלך תקופה זו, בצע מדידות של הצפיפות האופטית או OD ב-595 ננומטר, כמו גם פלואורסצנטיות mCherry ו-mCerulean באמצעות קורא צלחות כל 30 דקות.