כתב בדיקת דיכוי גנים לחקר רגולציה תרגומית של גן מטרה

חלבונים קושרי RNA, RBPs, מתפקדים כמווסתים לאחר שעתוק על ידי קשירה לאזור התחלת התרגום, TIR, של mRNA ודיכוי התרגום.

כדי לחקור אינטראקציות RNA-RBP באמצעות דיכוי תרגומי של גן מדווח, קח תרבית תאים חיידקית המכילה שני פלסמידים - אתר הקישור ופלסמידים RBP.

הפלסמיד באתר הקישור מקודד גן מדווח פלואורסצנטי. עם השעתוק, ה-TIR של ה-mRNA המתקבל מכיל אתר קשירת ריבוזום ומבנה סיכת ראש, עם רצף המזוהה על ידי RBPs.

ריבוזומים נקשרים לאתר הקישור ב-mRNA ומערערים את מבנה סיכת הראש, מה שמוביל לתרגום mRNA ולהיווצרות חלבון מדווח פלואורסצנטי. הפלסמיד RBP מבטא RBP כימרי המותך לחלבון פלואורסצנטי אחר. מקדם השראה שולט בביטוי החלבון הכימרי.

הוסף את המשרה המפעיל גורם שעתוק שנקשר למקדם, וגורם לביטוי חלבון כימרי. ה-RBP של החלבון הכימרי נקשר למבנה סיכת הראש. זה חוסם את הריבוזום מלהיקשר ל-mRNA, ומעכב את תרגום החלבון המדווח.

עם הגדלת ריכוז המשרה, ייצור ה-RBP עולה, וכתוצאה מכך עיכוב תחרותי חזק יותר של קשירת ריבוזומלי ל-mRNA.

מדוד את אותות הקרינה השונים מהחלבונים הכימריים והמדווחים. שרטט את האותות, וקבל את עקומת המינון-תגובה.

עם העלייה בתיווך המשרה בייצור RBP, דיכוי תרגומי מפחית את ריכוז החלבון המדווח, ומאשר אינטראקציה של RNA-RBP.

הפוך את הפלסמידים המוכנים לתאי חיידקים מוכשרים כימית שכבר מכילים פלסמיד RBP-mCerulean. כדי לחסו