אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:12 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לזהות אינטראקציות בין קומפלקסים של חלבונים הטרומריים הכוללים מספר חלבונים עם DNA מטרה באמצעות מבחן השמרים ההיברידי האחד שהשתנה, קח צלחת מרובת בארות המכילה ריכוז רצוי של תרבית תאי שמרים הגדלה באופן פעיל והשתנה.
תאים אלה מכילים רצף DNA ספציפי במעלה הזרם של הגן המקודד β-galactosidase, המונע על ידי מקדם GAL-4, תוך שהוא חסר את חלבון גורם השעתוק האנדוגני GAL-4. התאים מבטאים חלבון מטרה המאוחה לתחום ההפעלה GAL-4 וחלבון נוסף חסר תחום קשירת ה-DNA GAL-4.
אם חלבונים אלה מתקשרים, הם יכולים ליצור קומפלקס, המאפשר לחלבון המטרה להיקשר לרצף ה-DNA במעלה הזרם באזור המקדם של הגן המדווח. תחום ההפעלה GAL-4 מפעיל ביטוי אנזים מדווח β-גלקטוזידאז.
צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים במאגר מתאים. הקפיאו-הפשירו את התאים כדי לשחרר אותם ולשחרר β-גלקטוזידאז. הוסף בטא-מרקפטואתנול וחוצץ המכיל מצע β-גלקטוזידאז.
בטא-מרקפטואתנול מייצב את האנזים β-גלקטוזידאז. β-גלקטוזידאז מבצע הידרוליזה של מצע β-גלקטוזידאז, ויוצר כרומוגן צהוב.
הוסף תמיסת נתרן פחמתי לדנטורציה β-גלקטוזידאז ועצור את התגובה. צנטריפוגה. העבירו את הסופרנטנט המכיל כרומוגן צהוב לצלחת מרובת בארות. בעזרת קורא לוחות, מדוד את הצפיפות האופטית של התמיסה באורך גל מתאים כדי לחשב את פעילות ה-β-גלקטוזידאז.
פעילות גבוהה יותר של β-גלקטוזידאז מצביעה על אינטראקציות חיוביות בין החלבונים לרצף ה-DNA המטרה, מה שמוביל לביטוי β-גלקטוזידאז.
השעו מחדש את התרבית, והעבירו 125 מיקרוליטר מכל באר לצלחת ספקטרופוטומטר. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר כדי להבטיח שהיא בין 0.3 ל-0.6. צנטריפוגה התאים הנותרים בבאר העמוקה חוסמים ב -3,000 פעמים גרם ו -21 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את ה-supernatant על ידי היפוך.
הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר Z לכל באר ומערבולת. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 פעמים גרם ו -21 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר את ה-supernatant על ידי היפוך. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר Z לכל באר ומערבולת. מכסים את הצלחת בנייר כסף עמיד בפני מחזורי הקפאה-הפשרה.
במכסה אדים, בצע ארבעה מחזורים של הקפאה-הפשרה באמצעות חנקן נוזלי באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת Z-buffer/beta-mercaptoethanol/ONPG שהוכנה טרי לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 17 עד 24 שעות או עד להתפתחות הצבע. בדוק שהצבע התפתח.
הוסף 110 מיקרוליטר של נתרן פחמתי מולארי אחד לכל באר כדי לעצור את התגובה. רשום את השעה, וסובב את הצלחת. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 פעמים גרם ו -21 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 125 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל באר לצלחת ספקטרופוטומטר. מדוד את הצפיפות האופטית ב-420 ננומטר.