בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:12 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לזהות אינטראקציות בין קומפלקסים של חלבונים הטרומריים הכוללים מספר חלבונים עם DNA מטרה באמצעות מבחן השמרים ההיברידי האחד שהשתנה, קח צלחת מרובת בארות המכילה ריכוז רצוי של תרבית תאי שמרים הגדלה באופן פעיל והשתנה.
תאים אלה מכילים רצף DNA ספציפי במעלה הזרם של הגן המקודד β-galactosidase, המונע על ידי מקדם GAL-4, תוך שהוא חסר את חלבון גורם השעתוק האנדוגני GAL-4. התאים מבטאים חלבון מטרה המאוחה לתחום ההפעלה GAL-4 וחלבון נוסף חסר תחום קשירת ה-DNA GAL-4.
אם חלבונים אלה מתקשרים, הם יכולים ליצור קומפלקס, המאפשר לחלבון המטרה להיקשר לרצף ה-DNA במעלה הזרם באזור המקדם של הגן המדווח. תחום ההפעלה GAL-4 מפעיל ביטוי אנזים מדווח β-גלקטוזידאז.
צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים במאגר מתאים. הקפיאו-הפשירו את התאים כדי לשחרר אותם ולשחרר β-גלקטוזידאז. הוסף בטא-מרקפטואתנול וחוצץ המכיל מצע β-גלקטוזידאז.
בטא-מרקפטואתנול מייצב את האנזים β-גלקטוזידאז. β-גלקטוזידאז מבצע הידרוליזה של מצע β-גלקטוזידאז, ויוצר כרומוגן צהוב.
הוסף תמיסת נתרן פחמתי לדנטורציה β-גלקטוזידאז ועצור את התגובה. צנטריפוגה. העבירו את הסופרנטנט המכיל כרומוגן צהוב לצלחת מרובת בארות. בעזרת קורא לוחות, מדוד את הצפיפות האופטית של התמיסה באורך גל מתאים כדי לחשב את פעילות ה-β-גלקטוזידאז.
פעילות גבוהה יותר של β-גלקטוזידאז מצביעה על אינטראקציות חיוביות בי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים