מדידת פעילות מנחת מסוקים של חלבון מטרה באמצעות דופלקסים RNA המסומנים בביוטין

חלבונים עם פעילות הליקאז RNA יכולים לעזור לשחרר ולהפריד מולקולות RNA בודדות בדופלקס RNA.

כדי לקבוע את פעילות ההליקאז של חלבון, קח צינורות המכילים תערובת של דופלקסים RNA עם תווית ביוטין עם תלייה של 5', ATPs ומלכודות RNA - גדילים לא מסומנים המשלימים את הגדילים הביוטיניליים של הדופלקסים.

מוסיפים את החלבון עם פעילות הליקאז לכל צינור ודוגרים לפרקי זמן שונים. החלבון נקשר לתלייה של 5 'של הדופלקסים.

באמצעות מולקולות ATP, הוא שובר קשרי מימן בין שני גדילי דופלקס, וכתוצאה מכך הם מתפרקים ומשחררים את ה-RNA החד-גדילי הביוטיניל. מלכודות ה-RNA מקיימות אינטראקציה עם הגדילים המסומנים בביוטין, ומונעות חישול מחדש עם הגדילים המופרדים.

סיים את התגובה באמצעות מאגר סיום.

טען את הדגימות בבארות שונות של ג'ל פוליאקרילאמיד מקומי. הפעל אלקטרופורזה. RNA חד-גדילי בעל משקל מולקולרי נמוך נע מהר יותר מדופלקסים בעלי משקל מולקולרי גבוה. שינוי ניידות זה מייצר שתי רצועות נפרדות.

כתם את הג'ל על קרום ניילון, והעביר את ה-RNA לקרום. לאחר הספיגה, חשוף את הממברנה לאור UV, וקשר את ה-RNA על הממברנה.

הוסף סטרפטווידין מצומד אנזים כימילומינסנטי, המקיים אינטראקציה עם הביוטין על הדופלקסים והגדילים החד-גדיליים. השתמש במצעים כימילומינסנציוניים לייצור מוצרי כימילומינסנציה.

עם ההדמיה, עוצמת הרצועה בעלת המשקל המולקולרי הנמוך עולה עם הזמ