מדידת פעילות מנחת מסוקים של חלבון מטרה באמצעות דופלקסים RNA המסומנים בביוטין

חלבונים עם פעילות הליקאז RNA יכולים לעזור לשחרר ולהפריד מולקולות RNA בודדות בדופלקס RNA.

כדי לקבוע את פעילות ההליקאז של חלבון, קח צינורות המכילים תערובת של דופלקסים RNA עם תווית ביוטין עם תלייה של 5', ATPs ומלכודות RNA - גדילים לא מסומנים המשלימים את הגדילים הביוטיניליים של הדופלקסים.

מוסיפים את החלבון עם פעילות הליקאז לכל צינור ודוגרים לפרקי זמן שונים. החלבון נקשר לתלייה של 5 'של הדופלקסים.

באמצעות מולקולות ATP, הוא שובר קשרי מימן בין שני גדילי דופלקס, וכתוצאה מכך הם מתפרקים ומשחררים את ה-RNA החד-גדילי הביוטיניל. מלכודות ה-RNA מקיימות אינטראקציה עם הגדילים המסומנים בביוטין, ומונעות חישול מחדש עם הגדילים המופרדים.

סיים את התגובה באמצעות מאגר סיום.

טען את הדגימות בבארות שונות של ג'ל פוליאקרילאמיד מקומי. הפעל אלקטרופורזה. RNA חד-גדילי בעל משקל מולקולרי נמוך נע מהר יותר מדופלקסים בעלי משקל מולקולרי גבוה. שינוי ניידות זה מייצר שתי רצועות נפרדות.

כתם את הג'ל על קרום ניילון, והעביר את ה-RNA לקרום. לאחר הספיגה, חשוף את הממברנה לאור UV, וקשר את ה-RNA על הממברנה.

הוסף סטרפטווידין מצומד אנזים כימילומינסנטי, המקיים אינטראקציה עם הביוטין על הדופלקסים והגדילים החד-גדיליים. השתמש במצעים כימילומינסנציוניים לייצור מוצרי כימילומינסנציה.

עם ההדמיה, עוצמת הרצועה בעלת המשקל המולקולרי הנמוך עולה עם הזמן, בקורלציה עם פעילות ההליקאז של חלבון המטרה.

לבדיקת פעילות הליקאז MOV10, ערבבו את הריאגנטים לפי הוראות כתב היד, והוסיפו מים לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 30 דקות ו-60 דקות, ולאחר מכן, הוסיפו 5X Stop Buffer כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי של 20% וטענו 20 עד 25 מיקרוליטר מכל דגימה לכל באר. יש להריץ את הג'ל בעוצמה של 100 וולט על אמבט קרח עד שהסמן הכחול של הברומופנול נודד לרבע התחתון של הג'ל.

אקרילאמיד מזיק ורעיל. חשוב לטפל בזה עם ציוד מגן אישי מתאים.

לפרק את לוחות הג'ל ולקצץ את הג'ל על ידי הסרת בארות טעינה ונתיבים שאינם בשימוש. הנח את הג'ל במאגר TBE 0.5X. חותכים נייר סינון וקרום ניילון לגודל הג'ל, מרטיבים מראש את הנייר והממברנה ומרכיבים את הערימה להעברה.

העבירו את הדגימות מהג'ל לקרום במנגנון אלקטרופורטי חצי יבש בטמפרטורה של 90 מיליאמפר למשך 20 דקות. לאחר מכן, קשרו את הדגימות על ידי הקרנת הממברנה ב-120 מילי-ג'אול לסנטימטר בריבוע למשך 45 עד 60 שניות.

לזיהוי כימילומינסנציה, התחל בהוספת 20 מיליליטר של חיץ חוסם לממברנה ודגירה למשך 15 עד 30 דקות תוך ניעור עדין. הסר בזהירות את המאגר החוסם, והחלף אותו במאגר חוסם מצומד. דגרו שוב את הממברנה למשך 15 דקות.

שטפו את הממברנה ארבע פעמים תוך כדי ניעור במשך 5 דקות בכל שטיפה. לאחר מכן, הוסף 30 מיליליטר של מאגר שיווי משקל מצע לממברנה, ודגר אותו למשך 5 דקות תוך כדי ניעור במהירות של 20 עד 25 סל"ד.

מכסים את כל שטח הממברנה בתמיסת עבודה על המצע ודוגרים למשך 5 דקות. לאחר הדגירה, סרוק את הממברנה במערכת הדמיה כימית-לומינסנט למשך 1 עד 3 שניות.