הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

שבירות דו-גדיליות של DNA הנגרמות על ידי קרינה, או DSBs, יוזמות גיוס חלבון לתיקון DNA באתר הפגוע - ומפעילות תיקון DNA.

כדי לזהות את חלבוני תיקון ה-DNA γH2AX ו-53BP1 באתרי DSB באמצעות אימונופלואורסצנציה עקיפה, קח כיסויים המכילים תאי אפיתל. הקרנת תת-קבוצה של התאים. דגירה, מה שמאפשר לתאי הבקרה שאינם מוקרנים ומוקרנים לצמוח לזמנים ספציפיים.

טפל עם חיץ כדי לחלץ את גרעיני התא. תקן את גרעיני התא כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם. טפל בתמיסה חוסמת כדי למזער קשירת נוגדנים ראשונית לא ספציפית.

הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לשני חלבוני תיקון ה-DNA. הנוגדנים נקשרים לחלבונים המתאימים.

דגירה עם נוגדנים משניים המתויגים בפלואורופורים אדומים וירוקים, בהתאמה. הנוגדנים המשניים - ספציפיים לכל נוגדן ראשוני - נקשרים למטרותיהם. הוסף אמצעי הרכבה המכיל DAPI על שקופית זכוכית. הרכיב עליו את הכיסויים להדמיה.

DAPI - צבע קושר DNA - נקשר לחריצים הקטנים העשירים ב-AT, של ה-DNA הדו-גדילי, ומכתים את הגרעינים. דמיין את גרעיני התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בהשוואה לגרעיני תאים שאינם מוקרנים, גרעינים מוקרנים מציגים מוקדי γH2AX מרובים הפוחתים עם הזמן, מה שמעיד על תיקון DNA מתקדם בתאים הגדלים לתקופות ארוכות יותר.

אותות פלואורסצנטיים אדומים וירוקים חופפים מופיעים צהובים, מה שמעיד על לוקליזציה משותפת של γH2AX ו-53BP1 באתר DSB לאחר הקרנה.

התחל בגידול 40,000 תאי HeLa בכל באר של צלחת של 12 בארות עם כיסוי זכוכית עגול של 18 מילימטר למפגש של 80%. לאחר חשיפת התאים לקרינת גמא 4 אפור, יש לשטוף אותם פעמיים עם 1 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הסר את ה-PBS לחלוטין, והוסף 200 מיקרוליטר NEB לכל באר. דגרו את התאים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ואז הסירו את ה-NEB.

זכור שזמן הדגירה יכול להשתנות בהתאם לקו התא, אך בדרך כלל לא יעלה על שתי דקות. שוטפים את התאים עם 1 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הסר את ה-PBS לחלוטין, והוסף 200 מיקרוליטר של 4% PFA לכל באר לקיבוע תאים.

דגרו על התאים למשך 10 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס, לאחר מכן, הסירו את ה-PFA והוסיפו 1 מיליליטר PBS לכל באר. הסר PBS לחלוטין ולאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל באר, ודגר את התאים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או 16 עד 18 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.

לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר דילול, ולערבב אותו עד לערבוב טוב. בקופסת לחות, הדביקו חתיכת פרפילם, והוסיפו 10 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני בטיפה אחת. יישר קצה אחד של הכיסויהחלקה מהבאר עם הטיפה, והורד אותו לאט לאט על הפרפילם, ופזר את הנוזל. דגרו את הכיסוי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, שטפו את הכיסויים שלוש פעמים ב-PBS למשך דקה אחת לכל כביסה. יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר דילול ובמערבולת עד לערבוב אחיד. מרחו 10 מיקרוליטר של נוגדן משני על כל כיסוי כפי שתואר קודם לכן, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור.

שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS - ופעם אחת עם מים - למשך דקה אחת לכל כביסה. לאחר מכן, הרכיבו אותם על שקופיות זכוכית עם מדיית הרכבה מבוססת גליצרול המכילה DAPI. אטמו את הכיסויים עם לק שקוף, ותנו להם להתייבש במשך 20 דקות. הנח טיפה של שמן טבילה על עדשת האובייקט 60X, והשתמש ב-DAPI כדי לאתר את הגרעינים דרך העינית.

לרכישת תמונות XYZ, פתח את תוכנת הרכישה והגדר את "סוג סורק" כ-"Galvano", את "מצב סורק" כ-"הלוך ושוב" וגודל תמונה "512 על 512". בחלונית PMT, קבעו את המצב ל- VBM, את הממוצע ל- Frame ואת הסריקה הרציפה ל- Line. לאחר מכן, הגדר את גלאי הצבע והחום. הגדר את ערוץ 1 ל-DAPI ו-SD1, ערוץ שני ל-Alexa Fluor 488 ו-HSD3, וערוץ 3 ל-Alexa Fluor 647 ו-HSD4. בחר "ON" ב-"Z".

כדי לכוונן את התמונה החיה, לחץ על הלחצן Live בחלון החי והתאם את המיקוד. לאחר מכן, השתמש בחלון "כלי PMT" כדי להגדיר את עוצמת הלייזר, הרגישות, הרווח וההיסט. לערימות Z, בחר Start to End ו- 15 Slices. בחר את התיקיה לשמירת תמונות ולחץ על כפתור התחל LSM כדי להתחיל לרכוש. בסיום, לחץ על סדרה בוצעה כפתור כדי להשלים את רכישת התמונה.