אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 5:42 דק׳ • July 8th, 2025
שבירות דו-גדיליות של DNA הנגרמות על ידי קרינה, או DSBs, יוזמות גיוס חלבון לתיקון DNA באתר הפגוע - ומפעילות תיקון DNA.
כדי לזהות את חלבוני תיקון ה-DNA γH2AX ו-53BP1 באתרי DSB באמצעות אימונופלואורסצנציה עקיפה, קח כיסויים המכילים תאי אפיתל. הקרנת תת-קבוצה של התאים. דגירה, מה שמאפשר לתאי הבקרה שאינם מוקרנים ומוקרנים לצמוח לזמנים ספציפיים.
טפל עם חיץ כדי לחלץ את גרעיני התא. תקן את גרעיני התא כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם. טפל בתמיסה חוסמת כדי למזער קשירת נוגדנים ראשונית לא ספציפית.
הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לשני חלבוני תיקון ה-DNA. הנוגדנים נקשרים לחלבונים המתאימים.
דגירה עם נוגדנים משניים המתויגים בפלואורופורים אדומים וירוקים, בהתאמה. הנוגדנים המשניים - ספציפיים לכל נוגדן ראשוני - נקשרים למטרותיהם. הוסף אמצעי הרכבה המכיל DAPI על שקופית זכוכית. הרכיב עליו את הכיסויים להדמיה.
DAPI - צבע קושר DNA - נקשר לחריצים הקטנים העשירים ב-AT, של ה-DNA הדו-גדילי, ומכתים את הגרעינים. דמיין את גרעיני התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
בהשוואה לגרעיני תאים שאינם מוקרנים, גרעינים מוקרנים מציגים מוקדי γH2AX מרובים הפוחתים עם הזמן, מה שמעיד על תיקון DNA מתקדם בתאים הגדלים לתקופות ארוכות יותר.
אותות פלואורסצנטיים אדומים וירוקים חופפים מופיעים צהובים, מה שמעיד על לוקליזציה משותפת של γH2AX ו-53BP1 באתר DS
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים