RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

כדי לבודד חלבונים קושרי RNA, או RBPs - מווסתים לאחר שעתוק - קח השעיה של בדיקות RNA קטנות המכילות יסוד עשיר באדנילט-אורידילט, או ARE - רצף המזוהה על ידי RBPs המטרה. בדיקות ה-RNA מסומנות בדסטיוביוטין - נגזרת של ביוטין.

הוסיפו חרוזים מגנטיים מצופים בסטרפטווידין - חלבון בעל זיקה לביוטין. דגירה תחת תסיסה כדי למנוע מהחרוזים להתייצב. RNA המסומן על ידי דסטיוביוטין נקשר לסטרפטווידין, ובכך משתק את ה-RNA על החרוזים.

מתחת לשדה המגנטי, החרוזים נאספים בצד הצינור. הסר את ה-supernatant. השעו מחדש את החרוזים במאגר המספק pH אופטימלי לקשירת RBP-RNA.

עם החשיפה למגנט, חרוזים נאספים בצד הצינור. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את החרוזים בתמיסה המכילה את RBPs היעד ודגרו תחת תסיסה.

ל-RBPs היעד יש מוטיבים של זיהוי RNA המזהים את רצף ה-ARE ונקשרים ל-RNA, ובכך יוצרים קומפלקס חלבון RNA המשותק על החרוזים.

מתחת לשדה המגנטי, החרוזים נעים לעבר המגנט מבלי להפריע לאינטראקציות החלבון-RNA. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את החרוזים במאגר פליטה המכיל ביוטין.

ביוטין עוקר את הדסטיוביוטין מהחרוזים על ידי קשירה תחרותית לסטרפטווידין, ובכך מסלק את קומפלקס החלבון-RNA.

הערך את נוכחותם של RBPs המטרה ב-eluate כדי לאשר את האינטראקציות בין חלבון ל-RNA.

שטפו מראש 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין לכל 50 פיקומולים של RNA. מער