RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

כדי לבודד חלבונים קושרי RNA, או RBPs - מווסתים לאחר שעתוק - קח השעיה של בדיקות RNA קטנות המכילות יסוד עשיר באדנילט-אורידילט, או ARE - רצף המזוהה על ידי RBPs המטרה. בדיקות ה-RNA מסומנות בדסטיוביוטין - נגזרת של ביוטין.

הוסיפו חרוזים מגנטיים מצופים בסטרפטווידין - חלבון בעל זיקה לביוטין. דגירה תחת תסיסה כדי למנוע מהחרוזים להתייצב. RNA המסומן על ידי דסטיוביוטין נקשר לסטרפטווידין, ובכך משתק את ה-RNA על החרוזים.

מתחת לשדה המגנטי, החרוזים נאספים בצד הצינור. הסר את ה-supernatant. השעו מחדש את החרוזים במאגר המספק pH אופטימלי לקשירת RBP-RNA.

עם החשיפה למגנט, חרוזים נאספים בצד הצינור. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את החרוזים בתמיסה המכילה את RBPs היעד ודגרו תחת תסיסה.

ל-RBPs היעד יש מוטיבים של זיהוי RNA המזהים את רצף ה-ARE ונקשרים ל-RNA, ובכך יוצרים קומפלקס חלבון RNA המשותק על החרוזים.

מתחת לשדה המגנטי, החרוזים נעים לעבר המגנט מבלי להפריע לאינטראקציות החלבון-RNA. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את החרוזים במאגר פליטה המכיל ביוטין.

ביוטין עוקר את הדסטיוביוטין מהחרוזים על ידי קשירה תחרותית לסטרפטווידין, ובכך מסלק את קומפלקס החלבון-RNA.

הערך את נוכחותם של RBPs המטרה ב-eluate כדי לאשר את האינטראקציות בין חלבון ל-RNA.

שטפו מראש 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין לכל 50 פיקומולים של RNA. מערבולת את הצינור עם חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין למשך 15 שניות. לאחר מערבולת מהירה, הסר 200 מיקרוליטר לתוך צינור נעילה בטוח נקי של 1.5 מיליליטר באמצעות קצות פיפטה חתוכים. לאחר מכן, הניחו את הצינור על מעמד מגנטי כך שהחרוזים יתאספו בצד הצינור, והמתינו דקה אחת. הסר את נוזל ההשעיה.

כדי לשטוף את החרוזים, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי ב-400 מיקרוליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולרי, 0.05 תמיסת נתרן כלורי מולארי, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. הניחו את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי והמתינו דקה אחת, ואז אספו את הסופרנטנט.

שוטפים את החרוזים עם 200 מיקרוליטר נתרן כלורי 100 מילי-מולרי, ומסירים את הסופרנטנט. הוסף 200 מיקרוליטר של 20 טריס מילימולר. השעו מחדש את החרוזים על ידי פיפטינג והנח את הצינור על המעמד המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי ב-200 מיקרוליטר של מאגר לכידת RNA 1x והשהה מחדש חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין על ידי מערבולת קצרה.

הסר 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין והוסף אותם לכל צינור RNA מסומן באמצעות קצה פיפטה חתוך. דגרו את הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת. לאחר שהשפופרת הייתה על המעמד המגנטי במשך דקה אחת, הסירו את הסופרנטנט. הוסף לחרוזים 50 מיקרוליטר של טריס 20 מילימולר והשעה. לאחר מכן, הנח את הצינורות במעמד המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט.

הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר קושר חלבון-RNA פי 1x לחרוזים והשהה אותם מחדש. לאחר מכן, הנח את הצינורות בחזרה למעמד המגנטי. לאחר שהצינורות היו במעמד במשך דקה אחת, אספו את הסופרנטנט. הוסף 100 מיקרוליטר של תערובת מאסטר B. השהה מחדש על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה והימנע מיצירת בועות. דגרו צינורות תגובה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על רולר.

עברו לשלבי הכביסה והשטיפה. הנח את הצינורות במעמד מגנטי. אסוף את הזרימה והעביר אותה לצינור חדש. פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X על החרוזים. השעו בעדינות. החזר אותם למעמד. המתן דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. חזור על השלב פעמיים.

הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר פליטה לחרוזים המגנטיים. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודוגרים על שייקר צינורות. הנח את הצינורות במעמד מגנטי, המתן דקה אחת ואסוף דגימה. מניחים על קרח ומשתמשים לניתוח במורד הזרם.