ציטומטריית זרימה כמותית לחקר אינטראקציות שלפוחית חלבון-פוספוליפידים

אינטראקציות חלבון-פוספוליפידים על קרום התא חיוניות לוויסות של מספר תהליכים תאיים.

כדי לזהות אינטראקציות חלבון-פוספוליפידים מטרה במבחנה באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית, קח צינור המכיל ריכוז רצוי של חיקוי קרום התא - שלפוחיות פוספוליפידים בגודל מיקרון, מסומנות בצבע ליפופילי - במאגר.

הוסף ריכוז מתאים של חלבוני מטרה שונים המסומנים בפלואורסצנט בתמיסה.

הזרקו את המתלה לתוך ציטומטר הזרימה. הגדר את פרמטרי מערכת הנוזלים לקצב זרימה נמוך כדי לאפשר מספיק זמן לאינטראקציות חלבון-פוספוליפידים.

כאשר החלבונים המסומנים בפלואורסצנט ושלפוחיות הפוספוליפידים מתקשרים בערוץ הזרימה, ריכוז החלבונים הקשורים לשלפוחיות עולה.

כאשר קומפלקסים אלה עוברים דרך קרני הלייזר מתעלות פלואורסצנטיות ספציפיות המספקות אורכי גל מתאימים, הם מתרגשים. חלבונים נרגשים ושלפוחיות פוספוליפידים אלה במתחם פולטים אותות פלואורסצנטיים מתאימים עם הרפיה למצב הקרקע, הנלכדים על ידי הגלאים המתאימים.

זיהוי עוצמת הקרינה הממוצעת הגבוהה של החלבונים מעיד על קשירת חלבון לשלפוחיות הפוספוליפידים.

התחל את ניסויי הקישור הקינטי על ידי דילול שלפוחיות פוספוליפידים במאגר של טירוד לריכוז של 1 מיקרומולר ונפח כולל של 250 מיקרוליטר. לאחר מכן, ערבבו את גורם הקרישה המסומן בפלורסנט X או fX-fd בריכוז של 500 ננו-מולרי עם שלפוחיות הפוספוליפידים ביחס של 1:1 כדי לקבל נפח כולל של 500 מיקרוליטר.

הזרקו מיד 500 מיקרוליטר מהמתלה המעורב לתוך ציטומטר הזרימה בקצב זרימה באורך גל עירור של 488 ננומטר ומסנן פליטה של 585 ננומטר ברוחב של 42 לערוץ FL2.

לאחר מכן, מדוד את הקרינה הממוצעת בערוץ FL4 עם עירור ב-633 ננומטר ומסנן פליטה ב-660 ננומטר ברוחב של 20. כאשר מושגת רוויית הקשירה, יש לדלל במהירות את הדגימה פי 20 עם המאגר של טירוד, ולפקח על הדיסוציאציה עד שמגיעים לפלואורסצנטיות בסיסית או למישור.