הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:06 דק׳ • July 8th, 2025
חלבון היתוך אונקוגני כימרי מכיל את תחום המורכבות הנמוכה N-terminal, LCD, של חלבון קושר RNA המאוחה עם תחום קשירת ה-DNA, DBD, של חלבון גורם שעתוק. חלבונים אלה יוצרים עיבוי חלבון, המגייס RNA פולימראז-II ומניע אונקוגנזה.
כדי לדמיין את הרכבת עיבוי החלבון על ידי הדמיה של מולקולה אחת, התחל עם תא זרימת DNA - שקופית זכוכית סיליקה התמזגה המצוידת ביציאות הזרקת כניסה ויציאה. פני השטח של תא הזרימה מצופים בשכבת שומן דו-שכבתית ביוטינילית כדי להגן על פני השטח ומיוצרים עם מחסום זיגזג.
חבר אותו למערכת מיקרופלואידית. הכניסו תמיסה של סטרפטווידין, הנקשר לליגנד הזיקה הגבוה שלו, ביוטין, על שכבת השומנים. הזרקת DNA למבדה דו-גדילי מתויג ביוטין, המכיל חזרות מרובות של רצפי קשירת חלבון היתוך. הסטרפטווידין של שכבת השומנים הדו-שכבתית נקשר לביוטין של ה-DNA ומחבר את ה-DNA של הלמבדה לשכבה הדו-שכבתית.
שטוף עם מאגר מתאים. הכוח ההידרודינמי של הזרימה שלו מיישר את מולקולות ה-DNA המעוגנות, ומאפשר להן להיתלות כוילונות DNA מעל המחסומים.
הנח את תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. הזרקו תמיסה של פלואורופורים ירוקים קושרי DNA. לאחר מכן, הזרקו תמיסה של חלבון היתוך המתויג למג'נטה פלואורופור קושר חלבון דרך תחום ה-LCD שלו, ודגרו.
חלבוני ההיתוך המתויגים נקשרים לרצף המטרה ב-DNA הלמבדה ליצירת עיבוי לאורך ה-DNA. עם עירור, הפלואורו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים