בדיקת אפנון pH על שכבות שומנים נתמכות לזיהוי אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד

פוספטידילינוזיטול 4,5-ביספוספט, או PIP2, הוא פוספוליפיד זרחני מינורי הקשור לממברנה. פוספוליפאז C, או PLC, עם תחומי קשירה ספציפיים של PIP2, נקשר ל-PIP2, ויוצר שליחים משניים החיוניים למספר תהליכים תאיים.

כדי לזהות אינטראקציות PLC-PIP2 במבחנה, התחל עם שלפוחית חד-כילמית, רכב שטח, תרחיף חומצי, המורכב מתערובת PIP2 ופוספוליפידים, שאחד מהם מצומד לצבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH.

הכניסו את התמיסה לתוך צינור יציאה כניסה וחיבור של מכשיר מיקרו-נוזלי מיוצר שהורכב מראש. העבר ואבטח את המכשיר לשלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. דרך כוח הכבידה, רכבי שטח עוברים דרך רצפת המיקרו-ערוץ, העשויה מכיסוי זכוכית הידרופילית.

רכבי השטח נספגים על משטח הזכוכית, ה-pH של התמיסה מפחית את הדחייה האלקטרוסטטית בין השניים. רכבי השטח מתקשרים עם פני השטח, מתעוותים ומתמזגים ליצירת שלפוחיות גדולות.

לאחר כיסוי פני השטח הקריטי, השלפוחיות נקרעות באופן ספונטני, ויוצרות שכבת שומנים דו-שכבתית, SLB. העבירו חיץ דרך התעלה, והסירו שלפוחיות לא נספגות.

באמצעות ערוץ פלואורסצנטי מתאים, דמיין את המיקרו-ערוץ כדי לדמיין ולמדוד את הקרינה של הצבע הרגיש ל-pH - פלואורסצנטי מאוד ב-pH נמוך - ב-SLB.

הכנס תמיסת PLC רקומביננטית למיקרו-ערוץ. ה-pH הנייטרלי של התמיסה, מתחת לנקודה האיזואלקטרית של ה-PLC, הופך את ה-PLC למטען חיובי.

ה-PLC הרקומביננטי, עם תחום הקישור PIP2 שלו, נקשר ל-PIP2, ומגייס יוני הידרוקסיד טעונים שלילית למשטח הדו-שכבתי. זה הופך את המשטח הדו-שכבתי לבסיסי יותר, משנה את מצב הפרוטונציה של הצבע וגורם לכיבוי הקרינה, מה שמעיד על אינטראקציות PLC-PIP2.

העבירו 100 מיקרוליטר של הפוספטידיל אינוזיטול-4 5-ביספוספט המכיל שלפוחיות חד-צדדיות קטנות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.65 מיליליטר. התאם את ה-pH של התמיסה לכ-3.2 על ידי הוספת 6.4 מיקרוליטר של 0.2 חומצה הידרוכלורית רגילה.

פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת השלפוחית החד-כילמית-קטנה המותאמת ל-pH לכל תעלה דרך הכניסה ומפעילה לחץ דרך הפיפטה עד שהתמיסה מגיעה ליציאה. נתק את הקצה מהפיפטה והשאיר אותו מחובר למכשיר. לאחר חזרה על שלב זה עבור כל ערוץ, דגרו את המכשיר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

הזרקת שלפוחיות למיקרו-ערוצים צריכה להתבצע מיד לאחר הרכבת המכשיר. בינתיים, חותכים סטים של צינורות כניסה ויציאה. בעזרת פינצטה, חבר את ערכת צינורות השקע למכשיר ולאחר מכן, הדבק את המכשיר על במת מיקרוסקופ.

טבלו קצה אחד של צינור הכניסה המוגדר ב-25 מיליליטר של מאגר רץ הכלול בצינור חרוטי, והדביקו אותו כדי לוודא שהצינור מאובטח. בעזרת שקע מעבדה, הנח את הצינור החרוטי על קרקע גבוהה יותר מהמכשיר על מנת לדחוף את התמיסה דרך המיקרו-ערוצים באמצעות זרימת כוח הכבידה.

עבור כל צינור כניסה, השתמש במזרק כדי לשאוב 1 מיליליטר של מאגר רץ מהקצה החופשי של הצינור. הסר את קצה הפיפטה מהכניסה, והכנס את הקצה החופשי של צינור הכניסה לתוך המכשיר. חזור על תהליך זה כדי לחבר את כל חלקי צינורות הכניסה למכשיר. מאגר זורם זורם דרך התעלות מסייע בהסרת עודפי שלפוחיות לא קרועות ולאזן את השכבה הדו-שכבתית לתנאי ניסוי.

לאחר מכן, פתח את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. בחלונית השמאלית, לחץ על הכרטיסייה "מיקרוסקופ" ובחר במטרה "פי 10". לחץ על "חי" ולאחר מכן, על סמלי התמונה "Alexa 568" בסרגל הכלים. באמצעות כפתורי הכוונון עדין וגס, התמקד במיקרו-ערוצים. סרוק דרך המכשיר כדי לבדוק את איכות ה-SLB והערוצים.

לאחר מכן, לחץ על סמל התמונה "FL Shutter Closed" בסרגל הכלים. לחץ על הכרטיסייה "רכישה" ותחת "התאמות בסיסיות", בחר זמן חשיפה. הגדר את זמן החשיפה ל-200 אלפיות השנייה. בחלונית השמאלית, לחץ על "רכישה רב מימדית". בתפריט "מסננים", בחר את הערוץ האדום. לאחר מכן, לחץ על תפריט "Time-lapse". הגדר את מרווח הזמן ל-5 דקות, משך הזמן ל-30 דקות ותפריט הפסקה.

בחר בכלי "עיגול" בכרטיסייה "מדידה" וצייר עיגול בכל ערוץ. לחץ לחיצה ימנית בזמן שהעיגול נבחר ובחר "מאפיינים". תחת הכרטיסייה "פרופיל", סמן את "כל T" כדי להציג את עוצמת הקרינה כפונקציה של זמן. ודא שעקומה זו מגיעה לרמה, המעידה על שיווי משקל, לפני שתמשיך לשלב הבא.

הורד את תמיסת החיץ לקרקע שווה כמו המכשיר כדי לעצור את הזרימה. בזה אחר זה, נתק כל צינור יציאה והחל 200 מיקרוליטר מכל דילול חלבון לתעלת היציאה באמצעות פיפטה. אל תפעיל לחץ כלשהו. תנו לכוח המשיכה לעשות את העבודה. נתק את הקצה מהפיפטה והשאיר אותו מחובר למכשיר המיקרופלואידי. חזור על תהליך זה עבור כל ערוץ, וכדי לוודא כי בועות אוויר לא מוכנסות לתעלות במהלך תהליך זה.

לאחר מכן, הורד את צינור הכניסה לקרקע מתחת למכשיר המיקרופלואידי כדי להתחיל להזרים את החלבון דרך המיקרו-ערוצים. הדביקו את הקצה החופשי של הצינור למיכל פסולת. זרם את הדילולים של תחום ההומולוגיה של פלקסטרין למשך 30 דקות. בחלונית השמאלית של התוכנה, תחת הכרטיסייה "Time-Lapse", לחץ על "התחל" כדי להתחיל שוב בהדמיה.