כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם פיזור אור רב-זוויתי עבור אוליגומרים חלבונים

אוליגומר חלבון הוא קומפלקס של תת-יחידות חלבון מרובות הקשורות יחד ליצירת יחידה פונקציונלית גדולה יותר.

כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של מונומרים חלבונים והאוליגומרים שלהם בתמיסה על ידי SEC-MALS, שילוב של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ופיזור אור רב-זוויתית, התחל בעמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, או SEC.

העמוד מכיל חרוזי ג'ל כדוריים דמויי מסננת נקבוביים הלוכדים בתוכם מולקולות קטנות יותר. איזון העמודה עם מאגר התואם למצב המקורי של החלבון.

טען דגימה המכילה מונומרים ואוליגומרים של חלבון בראש העמודה.

במהלך הזרימה, האוליגומרים עוברים דרך החלל הבין-חלקיקי של העמוד, בעוד המונומרים נלכדים בתוך נקבוביות החרוזים. זה גורם לאוליגומרים החלבונים הגדולים יותר לנוע מהר יותר מאשר המונומרים הקטנים יותר.

כוון את האוליגומרים המהירים, ואחריהם את המונומרים האיטיים, לגלאי MALS.

כשהם עוברים דרך הגלאי, אור לייזר מאיר אותם, המפוזר בזוויות שונות. האוליגומרים מרובי תת-היחידות מפזרים יותר אור מאשר המונומר.

עוצמת האור המפוזר במספר זוויות עומדת ביחס ישר למשקל המולקולרי של החלבון אוליגומר ומונומר.

התחל הליך זה בהכנת מערכת SEC-MALS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעזרת ריאגנטים בדרגת HPLC, הכינו ליטר אחד של מי מלח עם פוספט עם 50 עד 100 מיליליטר נתרן כלורי. מסננים את המאגר ל-0.1 מיקרון באמצעות מסנן פוליאתר סולפון בבקבוק או דומה.

סנן את 50 עד 100 מיליליטר המאגר הראשונים לבקבוק פסולת על מנת לסלק חלקיקים מהמסננים היבשים. לאחר מכן, סנן את השארית לבקבוק נקי וסטרילי שנשטף בעבר במים מסוננים ונטולי יונים ונשמר כדי למנוע כניסת אבק.

שטוף את העמודה למשך הלילה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה כדי לאזן את העמודה במאגר ולהסיר חלקיקים. השתמש במצב "זרימה רציפה" של FPLC, וודא שהזרימה לא תיפסק עד להשלמת כל ריצות ה-SEC-MALS. הנח את תא הזרימה של dRI במצב טיהור במהלך שטיפת הלילה.

בעת תחילת השטיפה, הגבירו בהדרגה את קצב הזרימה כדי למנוע את אפקט "שפיכת העמודים" הנגרם כתוצאה משינוי לחץ פתאומי בעמודה. כבה את הטיהור לפני תחילת ריצות הדגימה.

בדוק את ניקיון המערכת על ידי הקשה קלה על הצינור במורד העמוד כדי לשחרר חלקיקים שהצטברו. שים לב לאות בגלאי 90 מעלות בתצוגת הלוח הקדמי של מכשיר MALS. ודא שהרעש משיא לשיא הוא לא יותר מ-50 עד 100 מיקרו-וולט. כמו כן, ודא שמקדם השבירה או אות ה-RI יציב לפחות ^{מ-1 x 10-7} יחידות מקדם שבירה.

בצע הזרקה 'ריקה' כדי לוודא שהמזרק נקי מחלקיקים. 'ריק' הוא פשוט המאגר הפועל שהוכן בבקבוקון סטרילי טרי. אם שיא החלקיקים הוא לא יותר מ -1 מיליליטר בנפח, ולא יותר מ -5 מילי-וולט מעל קו הבסיס, המערכת מוכנה לדגימות. אחרת, בצע הזרקות ריקות נוספות עד לניקוי או בצע תחזוקה לניקוי המזרק.

כעת, הכינו לפחות 200 מיקרוליטר של BSA ב-1 עד 2 מיליגרם למיליליטר במאגר ה-SEC. סנן את החלבון ל -0.025 מיקרון באמצעות מסנן קצה מזרק. השליכו את טיפות הסינון הראשונות על מנת לסלק חלקיקים מהפילטרים היבשים. לחלופין, צנטריפוגה של הדגימה ב-10,000 פעמים גרם למשך 15 דקות כדי לאפשר משקעים של אגרגטים לא מסיסים וחלקיקים גדולים אחרים. לאחר מכן, הזרקו 100 מיקרוליטר מתמיסת ה-BSA לתוך הלולאה.