אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 7:16 דק׳ • July 8th, 2025
קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית מסייעת לחקור אינטראקציות ביומולקולות-ליגנד על ידי מדידת החום הנדרש כדי לנטרל את הביו-מולקולה בהיעדר ונוכחות הליגנד.
כדי להתחיל, קח התייחסות המכילה אפטמרים DNA חופשיים - אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים מובנים - ודגימה המכילה אפטמרים הקשורים לליגנד תרמו-לביליים. הליגנדים מייצבים את המבנה המשני של האפטאמר.
בצע סריקה קדימה על ידי חימום התמיסות. עם הגעתם לטמפרטורת ההיתוך, האפטמרים החופשיים מתפרקים.
האפטמרים המיוצבים על ידי ליגנד מתנתקים מהליגנדים ומתפרקים בטמפרטורה גבוהה יחסית, מה שגורם לעלייה בטמפרטורת ההיתוך בהשוואה לאפטמרים החופשיים. בטמפרטורות גבוהות, תת-קבוצה של ליגנדים מקבלת צורה משנית בלתי הפיכה עם זיקה מחייבת נמוכה.
לאחר מכן, בצע סריקה הפוכה על ידי קירור התמיסות על מנת להחזיר את מבנה האפטמר. בטמפרטורה הנמוכה יותר, הליגנדים הראשוניים וההמורים בדגימה נקשרים לאפטמרים.
במהלך הסריקה הקדמית השנייה, האפטמרים הקשורים בזיקה חלשה לליגנדים המומרים מתנתקים ומתפרקים בטמפרטורה נמוכה יותר מאשר האפטמרים הראשוניים הקשורים לליגנד, מה שגורם להורדת הילוך בטמפרטורת ההיתוך.
עם סריקות עוקבות, הליגנדים ממשיכים להמיר לצורה המשנית, וכתוצאה מכך הדלדול המוחלט של הצורה הראשונית. השג את התרמוגרמה.
עם כל סריקה, טמפרטורת ההיתוך של האפטמר הקשור לליגנד משתנה לכיוון האפטמר החופשי, מה שמעיד על זיקת הקישור החלשה של הצורה המשנית.
הסר את תמיסות המאגר, הביו-מולקולה והליגנד במסיר גז על השולחן לפני הטעינה לתוך קלורימטר הסריקה הדיפרנציאלי, או DSC. נתק את ידית הלחץ מה- DSC. לאחר מכן, הפעל צינורות סיליקון ממאגר העבודה, והצמד אותו לאוגן הקדמי של נימי הייחוס.
צור גשר בין הייחוס לנימים לדוגמה על ידי חיבור אוגן הייחוס האחורי לאוגן הדגימה הקדמי. לאחר מכן, חבר חתיכת צינור סיליקון לאוגן הדגימה האחורי שעובר לבקבוק פסולת עם קו ואקום מחובר. הפעל את קו הוואקום כדי לשטוף את ה- DSC עם 200 מיליליטר של מאגר עבודה.
התחל בהצמדת קטעי צינורות סיליקון בגודל של 3 עד 5 סנטימטרים בערך לאוגני נימי הייחוס. לאחר מכן, הכנס קצה פיפטה של 1 מיליליטר לצינור הסיליקון של האוגן האחורי. צייר 0.8 מיליליטר של מאגר עבודה עם פיפטה, והכנס את קצה הפיפטה עם המאגר לתוך צינור הסיליקון של אוגן הייחוס הקדמי.
לחץ בעדינות על בוכנת הפיפטה כלפי מטה כדי להעביר את מאגר העבודה דרך צינור הסיליקון הקדמי לתוך נימי הייחוס ולמעלה לקצה הפיפטה המצורף של האוגן האחורי. לחץ על בוכנת הפיפטה כלפי מטה עד שרמת החיץ העובדת תגיע ממש מעל צינור הסיליקון הקדמי. לאחר מכן, שחרר את בוכנת הפיפטה עד שמפלס החיץ העובד יגיע ממש מעל צינור הסיליקון האחורי. המשך להעביר את מאגר העבודה קדימה ואחורה בנימי הייחוס כדי לטהר את נפח הבועות.
לאחר מכן, כסו את קצה הפיפטה האחורית באצבע המורה ומשכו בעדינות כלפי מעלה את קצה הפיפטה האחורית ואת הפיפטה הקדמית כדי להסיר אותם מאוגני הייחוס כשצינור הסיליקון מחובר. טען את נימי הדגימה עם מאגר עובד כמו קודם.
הנח מכסה פלסטיק שחור על אוגני הייחוס האחוריים והדגימה, והשאיר את האוגנים הקדמיים חשופים. חבר את ידית הלחץ ל-DSC ולאחר מכן, פתח את תוכנת DSC ולחץ על המכשיר על ידי לחיצה על החץ האדום "למעלה" בחלק העליון של הממשק לאחר שקריאת ההספק התייצבה. הספק ה-DSC מצוין בתיבה בפינה השמאלית העליונה של הממשק, יחד עם טמפרטורת המכשיר וקריאת הלחץ.
אזן את ה-DSC עם מאגר עבודה על ידי ביצוע סריקה קדימה ואחורה. בכרטיסייה "שיטה ניסיונית" בצד שמאל של המסך, ודא שהאפשרות "סריקה" נבחרה להפעלת ה-DSC במצב סריקת טמפרטורה.
בכניסה "פרמטרי טמפרטורה" תחת הכרטיסייה "שיטה ניסיונית", לחץ על כפתור החימום. הזן 1 ו-100 מעלות צלזיוס עבור טמפרטורות הניסוי התחתונות והעליונות, 1 מעלות צלזיוס לדקה עבור קצב הסריקה ו-60 שניות עבור תקופת שיווי המשקל. לחץ על כפתור "הוסף סדרה" מתחת לשדה הקלט לתקופת שיווי המשקל. הזן 2 בשדה "שלבים להוספה" בחלון המוקפץ וסמן את התיבה "חימום/קירור חלופי". לחץ על "אישור".
הסריקות שנוספו מופיעות בחלק התחתון של הממשק. בדוק שהפרמטרים עבור כל סריקה הם כרצונך. התחל את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור הירוק "הפעל" בחלק העליון של הממשק. נווט לחלון הרצוי והזן שם קובץ לשמירת הניסוי בחלון המוקפץ. הצג את התקדמות הניסוי על ידי לחיצה על הכרטיסייה "נתונים" מימין לכרטיסייה "שיטת ניסוי".
הפעל ניסויי ייחוס לחיסור בסיסי של נתוני הדגימה על ידי טעינה מחדש של ה-DSC עם מאגר עבודה בשני הנימים. אסוף מספר סריקות קדימה ואחורה בטווח טמפרטורות מתאים ב-1 מעלות צלזיוס לדקה עם זמן שיווי משקל עליון של 120 שניות.
מחק את סריקות שיווי המשקל הקודמות מהחלק התחתון של הממשק על ידי הדגשת כל אחת בנפרד ולחיצה על ה-"X" האדום בפינה השמאלית האמצעית של הממשק.
הוסף את הסריקות החדשות על ידי לחיצה על כפתור "הוסף סדרה", הזנת 20 בשדה עבור "שלבים להוספה" וסימון התיבה "חימום/קירור חלופי". לאחר מכן, לחץ על "אישור" והפעל את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור הירוק "הפעל" כמו קודם.
חזור על שלבים אלה עם מאגר עבודה המכיל את הריכוז הרצוי של ליגנד בשני הנימים כדי להשיג את ניסויי הייחוס עבור הליגנד. אסוף שני ניסויים נפרדים שישמשו ברכישת קבוע הקצב להמרת ליגנד תרמו-לביל.
עבור מערך הנתונים של הביו-מולקולה החופשית, הבטיח שנימי הייחוס מכילים את המאגר העובד, בעוד שנימי הדגימה מכילים את הביו-מולקולה החופשית בריכוז הרצוי במאגר העבודה. לאחר מכן, הפעל את הניסויים לדוגמה באמצעות אותו הליך טעינת DSC ופרמטרים ניסיוניים המשמשים בסריקות הייחוס.
עבור הניסויים הקשורים לליגנד, ודא שהליגנד נמצא במאגר העבודה בנימי הייחוס והביו-מולקולה בתוספת ליגנד נמצאים במאגר העבודה בנימי הדגימה. שטפו את המערכת בין תוספות של ליגנדים שונים כמו קודם.
בצע ניסוי נוסף אחד עם הביו-מולקולה הקשורה לליגנד התרמו-לאביל שבו תקופת שיווי המשקל בטמפרטורה גבוהה מוגברת ל-600 שניות, וכל שאר הפרמטרים הניסיוניים זהים לקודם. המשך לעיבוד וניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.