בדיקת קשירה תחרותית לזיהוי תרכובות המשבשות אינטראקציות קולטן-ליגנד

מבחן הקישור התחרותי מזהה מולקולות קטנות המשבשות אינטראקציות קולטן-ליגנד על ידי קשירה תחרותית לקולטן מטרה, ומעכב קשירת ליגנד טבעית.

כדי לזהות אינטראקציות של קולטן עם הליגנד הטבעי שלו בנוכחות אנטגוניסט מולקולה קטנה ספציפית לקולטן, התחל בהשעיה של תאי לימפוציטים T אנושיים המבטאים את קולטן המטרה.

הוסף את תרחיף התאים לבארות של צלחת מרובת בארות המכילה ריכוזי אנטגוניסטים הולכים וגדלים. דגירה. האנטגוניסט נקשר לאתר הקישור האורתסטרי - אתר קשירת הליגנד הטבעי של הקולטן.

הוסף לבארות ריכוז קבוע של ליגנדים טבעיים עם תווית פלואורסצנטית. דגירה.

בריכוזים נמוכים, האנטגוניסטים תופסים מעט אתרי קשירה אורתוסטריים, מה שמאפשר קשירת ליגנד טבעית לקולטנים. עם זאת, בריכוזים גבוהים יותר, האנטגוניסטים תופסים את רוב אתרי הקישור האורתוסטריים, מה שמאפשר קשירה טבעית מינימלית של קולטני ליגנד.

צנטריפוגה לכדור התאים. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים בפרפורמלדהיד כדי לתקן אותם, תוך שמירה על המורפולוגיה התאית.

בעזרת ציטומטר זרימה, נתח את אותות הקרינה מלימפוציטים T בודדים המבטאים את הקולטנים הקשורים לליגנד אנטגוניסטים ופלואורסצנטיים.

ירידה תלוית מינון בעוצמת הקרינה הממוצעת עם עלייה בריכוזי אנטגוניסטים ספציפיים לקולטן מצביעה על קשירה תחרותית של האנטגוניסטים לאתרי קשירת הקולטן האורתוסטריים, ומעכבת אינטראקציה טבעית של ליגנד-קולטן.

כדי להתחיל, חלקו 100 מיקרוליטר של תמיסה מורכבת לצלחת תחתונה עגולה שקופה של 96 בארות על פי פריסת ניסוי מוגדרת מראש.

הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ממאגר ריאגנטים לתוך צלחת 96 הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. דוגרים את הצלחת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיליליטר CXCL12 המסומן פלואורסצנטי ממאגר ריאגנטים דומה לבארות של צלחת 96 הבארות. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן, צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות בכוח הכבידה פי 400 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט מהתאים הגלולים על ידי היפוך הצלחת. יבש את הצלחת על טישו. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר בדיקה טרי ממאגר ריאגנטים לבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית.

המשך מיד לצנטריפוגה שוב של הצלחת למשך 5 דקות בכוח הכבידה פי 400 בטמפרטורת החדר. שוב, הסירו את הסופרנטנט על ידי הפיכת הצלחת ולאחר מכן ייבושה על טישו. לבסוף, השעו בעדינות את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של 1% פרפורמלדהיד מומס ב-PBS. שלב זה יתקן את התאים.

כדי לנתח את הדגימות לפי ציטומטריית זרימה, הפעל את המכשיר ופתח את התוכנה המתאימה. בחר את הפרמטרים הסלולריים שיוצגו בפורמט כתמי נקודות כאזור פיזור קדימה, אזור פיזור צדדי, ובתצוגת היסטוגרמה, ערוץ זיהוי הפלואורופור.

בחר דגימה אחת, למשל, דגימת בקרה שלילית, כדי לבצע שער של אוכלוסיית תאים הומוגנית מוגדרת על סמך פרמטרי הפיזור קדימה ופיזור הצד. התאם את ההגדרות להעמסת התאים למכשיר ציטומטריית הזרימה.

בחר שלוש תערובות לפני ההזרקה. בחר הזרקה אוטומטית של 100 מיקרוליטר של תאים קבועים, והשתמש בקצב זרימת דגימה של 1.5 מיקרוליטר לשנייה. הפעל את הדוגמה על-ידי בחירה באפשרות "השג נתונים". פרמטרי הפיזור קדימה ופיזור הצד עבור דגימה זו כמו גם זיהוי הפלואורופור יופיעו כעת על המסך.

כעת, בחר את כלי השער של התוכנה. בהתבסס על הדמיית תרשים נקודות פיזור קדימה ופיזור צד, הגדר מראש אוכלוסיית תאים הומוגנית ובת קיימא על ידי שער. בחר כדי לנתח 20,000 "אירועים" לכל מדגם.

המשמעות היא שעבור כל דגימה, 20,000 תאים הנופלים בתוך שער מוגדר מראש ינותחו בסופו של דבר. איסוף הנתונים יימשך עד שיגיע למספר זה של אירועים.

התחל את הריצה על ידי בחירת הבארות שיש לנתח תחילה. לאחר מכן, בחר "Run Wells".

מכשיר ציטומטריית הזרימה ינתח כעת את הדגימות הללו בזו אחר זו על ידי רישום עוצמת הקרינה הממוצעת עבור כל דגימה, התואמת את האות הפלואורסצנטי הממוצע מ-20,000 התאים הנופלים בתוך השער שהוגדר מראש.

לבסוף, בצע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול.