בדיקת קשירה תחרותית לזיהוי תרכובות המשבשות אינטראקציות קולטן-ליגנד

מבחן הקישור התחרותי מזהה מולקולות קטנות המשבשות אינטראקציות קולטן-ליגנד על ידי קשירה תחרותית לקולטן מטרה, ומעכב קשירת ליגנד טבעית.

כדי לזהות אינטראקציות של קולטן עם הליגנד הטבעי שלו בנוכחות אנטגוניסט מולקולה קטנה ספציפית לקולטן, התחל בהשעיה של תאי לימפוציטים T אנושיים המבטאים את קולטן המטרה.

הוסף את תרחיף התאים לבארות של צלחת מרובת בארות המכילה ריכוזי אנטגוניסטים הולכים וגדלים. דגירה. האנטגוניסט נקשר לאתר הקישור האורתסטרי - אתר קשירת הליגנד הטבעי של הקולטן.

הוסף לבארות ריכוז קבוע של ליגנדים טבעיים עם תווית פלואורסצנטית. דגירה.

בריכוזים נמוכים, האנטגוניסטים תופסים מעט אתרי קשירה אורתוסטריים, מה שמאפשר קשירת ליגנד טבעית לקולטנים. עם זאת, בריכוזים גבוהים יותר, האנטגוניסטים תופסים את רוב אתרי הקישור האורתוסטריים, מה שמאפשר קשירה טבעית מינימלית של קולטני ליגנד.

צנטריפוגה לכדור התאים. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים בפרפורמלדהיד כדי לתקן אותם, תוך שמירה על המורפולוגיה התאית.

בעזרת ציטומטר זרימה, נתח את אותות הקרינה מלימפוציטים T בודדים המבטאים את הקולטנים הקשורים לליגנד אנטגוניסטים ופלואורסצנטיים.

ירידה תלוית מינון בעוצמת הקרינה הממוצעת עם עלייה בריכוזי אנטגוניסטים ספציפיים לקולטן מצביעה על קשירה תחרותית של האנטגוניסטים לאתרי קשירת הקולטן האורתוסטריים, ומעכבת אינטראקציה טבעית של