JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:35 דק' • July 8th, 2025
כדי לחקור אינטראקציות קולטן-ליגנד, התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה מדיה עם תאי מטרה המבטאים ליגנדים של בדיקה על פני השטח שלהם.
הוסף תאי BW מהונדסים של עכבר - אוכלוסיית תאי B חדשה המבטאת קולטנים כימריים הקשורים לממברנה. קולטנים כימריים מהווים את התחום החוץ-תאי של קולטן ספציפי המאוחה לתחום האיתות הטרנסממברני והתוך-תאי של קולטן תאי B.
ליגנדים על תאי המטרה מקיימים אינטראקציה עם התחום החוץ-תאי של הקולטנים הכימריים של תאי BW, וגורמים להפעלת תחום האיתות התוך תאי בתאי BW. זה מפעיל איתות במורד הזרם וייצור ציטוקינים - מולקולות מדווחות מפרישות המשתחררות מחוץ לתאי ה-BW, המופיעות בתקשורת.
צנטריפוגה את הצלחת. העבירו את הסופרנטנט המכיל ציטוקינים לתוך צלחת ELISA המצופה מראש בנוגדנים נגד ציטוקינים. ציטוקינים מקיימים אינטראקציה עם אזורי ה-Fab של הנוגדנים, מה שמוביל לקיבוע שלהם על פני הצלחת.
טפל בצלחת בתמיסת חסימה לחסימת אתרי קשירה לא ספציפיים. הוסף נוגדנים אנטי-ציטוקינים ביוטיניליים, המקיימים אינטראקציה עם ציטוקינים קשורים מראש ויוצרים קומפלקסים חיסוניים.
שכבו את הצלחת בתמיסת סטרפטווידין מצומדת אנזים. סטרפטווידין נקשר לביוטין על קומפלקסים חיסוניים.
טפל בצלחת במצע. האינטראקציה בין אנזים למצע מייצרת מוצר צבעוני, המקנה את אותו צבע לתמיסה. התמיסה הצבעונית מאשרת את נוכחותן של מולקולות מדווחות, מה שמעיד על אינטראקציה מוצלחת בין קולטן-ליגנד.
השתמש ב-50,000 תאי BW שעברו טרנספטציה עם המטרות הרצויות שלהם בבאר אחת של צלחת של 96 בארות. דגרו את הצלחת למשך 48 שעות. לאחר מכן, הקפיאו את הצלחת בחום של -20 מעלות צלזיוס.
מצפים צלחת ELISA בנוגדנים IL-2 נגד עכבר. הניחו 0.05% מיקרוגרם של אנטי עכבר-IL-2 בנפח של 50 מיקרוליטר PBS בכל באר. דגרו את הצלחת המצופה למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
השתמש בתקופת דגירה קצרה ב-37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר את תאי ה-BW הקפואים שהודגרו בעבר עם המטרות שלהם. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת, והעבירו 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל באר לצלחת ELISA המצופה מראש, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
לאחר מכן, הוסף ביוטין נגד עכבר-IL-2 לצלחת ELISA. לאחר מכן, לאחר הדגירה והכביסה, הוסיפו לצלחת סטרפטווידין מצומד HRP. לאחר הדגירה והכביסה, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת המצע TMB לכל באר בצלחת ELISA. לבסוף, קרא את לוחית ELISA ב-650 ננומטר.