בדיקת כתב מבוססת ELISA לחקר האינטראקציה בין קולטן לליגנד בתאי BW
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:35 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לחקור אינטראקציות קולטן-ליגנד, התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה מדיה עם תאי מטרה המבטאים ליגנדים של בדיקה על פני השטח שלהם.
הוסף תאי BW מהונדסים של עכבר - אוכלוסיית תאי B חדשה המבטאת קולטנים כימריים הקשורים לממברנה. קולטנים כימריים מהווים את התחום החוץ-תאי של קולטן ספציפי המאוחה לתחום האיתות הטרנסממברני והתוך-תאי של קולטן תאי B.
ליגנדים על תאי המטרה מקיימים אינטראקציה עם התחום החוץ-תאי של הקולטנים הכימריים של תאי BW, וגורמים להפעלת תחום האיתות התוך תאי בתאי BW. זה מפעיל איתות במורד הזרם וייצור ציטוקינים - מולקולות מדווחות מפרישות המשתחררות מחוץ לתאי ה-BW, המופיעות בתקשורת.
צנטריפוגה את הצלחת. העבירו את הסופרנטנט המכיל ציטוקינים לתוך צלחת ELISA המצופה מראש בנוגדנים נגד ציטוקינים. ציטוקינים מקיימים אינטראקציה עם אזורי ה-Fab של הנוגדנים, מה שמוביל לקיבוע שלהם על פני הצלחת.
טפל בצלחת בתמיסת חסימה לחסימת אתרי קשירה לא ספציפיים. הוסף נוגדנים אנטי-ציטוקינים ביוטיניליים, המקיימים אינטראקציה עם ציטוקינים קשורים מראש ויוצרים קומפלקסים חיסוניים.
שכבו את הצלחת בתמיסת סטרפטווידין מצומדת אנזים. סטרפטווידין נקשר לביוטין על קומפלקסים חיסוניים.
טפל בצלחת במצע. האינטראקציה בין אנזים למצע מייצרת מוצר צבעוני, המקנה את אותו צבע לתמיסה. התמיסה הצבעונית מאשרת את נוכחותן של מולקולות מדווחות, מה שמעיד ע
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים