Biomembrane Force Probe כדי לכמת אינטראקציות קולטן-ליגנד

האינטראקציה בין קולטן תאי T, TCR, ופפטיד אנטיגני המוצג על ידי MHC, או קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי, על תא מציג אנטיגן, APC, גורמת לתא T להפעיל כוח מכני על ה-APC. תופעה זו הכרחית להפעלת תאי T.

כדי לכמת אינטראקציות קולטן-ליגנד באמצעות בדיקת כוח ביו-ממברנה, BFP, התחל עם תא תא מותאם אישית מבוסס שקופיות. הנח את תא התא מתחת למיקרוסקופ.

הזרקת תרחיפים של RBCs נפוחים ביוטיניליים, חרוזי זכוכית בדיקה המצופים בקומפלקסים MHC-סטרפטווידין-ביוטין הקשורים לפפטיד, ותאי T לתוך החדר. מקם את המיקרו-פיפטות המלאות במאגר הבדיקה, המטרה והמסייע, סביב החדר.

שאפו RBC ביוטיניל עם פיפטת הבדיקה, ומקמו אותו באזור ריק. שאפו תא T עם מיקרופיפטת המטרה, ומקמו אותו בצד ימין של ה-RBC. שאפו חרוז בדיקה עם המיקרופיפטה המסייעת, והצמידו אותו לקודקוד ה-RBC. הסטרפטווידין של החרוז נקשר לביוטין של ה-RBC ויוצר בדיקת כוח.

יישר את תא ה-T עם בדיקת הכוח כדי לאפשר ל-TCR לקיים אינטראקציה עם הליגנד שלו - הפפטיד הקשור ל-MHC - ותא ה-T להפעיל כוח על ה-RBC. החזר את תא ה-T כדי לשבור את הקשר TCR-פפטיד, המעוות את ה-RBC ומעביר את החרוז.

מדוד את הכוח הדרוש כדי לשבור את הקשר - קשר חזק יותר זקוק לכוח גבוה יותר וזמן רב יותר לשבירה, מה שמעיד על אורך חיים ארוך יותר.

כדי להתחיל בניסוי BFP, הפעילו את המיקרוסקופ ואת מקור האור. הנח את החדר על המיקרוסקופ הראשיtage. השלב הבא הוא התקנת כל שלושת המיקרו-פיפטות של ה-BFP. הגשושית משמאל היא לתפוס RBC. המטרה מימין היא לתפוס את התא, והעוזר מימין למטה משמש לתפיסת חרוז.

כדי להתקין, השתמש במיקרו-מזרק כדי למלא מחדש מיקרו-פיפטה עם מאגר ניסיוני. הסר את המיקרופיפטה ממחזיק הפיפטה, והחזק אותה במקום נמוך יותר כדי לאפשר לנוזל לטפטף מהקצה. במהירות, הכנס את המיקרופיפטה לקצה המחזיק, וודא שאף מיקרו-בועת אוויר לא נכנסת למיקרופיפטה במהלך ההחדרה.

הדק את בורג המחזיק, ולאחר מכן, התקן כל מחזיק פיפטה על המיקרומניפולטור המתאים לו. דחוף את המיקרופיפטה לכיוון החדר כך שקצותיהם ייכנסו לאזור חיץ החדר. התאם את מיקום המיקרופיפטה, ומצא אותם מתחת לשדה הראייה של המיקרוסקופ.

הסתובב סביב הבמה של בעל הלשכה כדי למצוא את המושבות של שלושת האלמנטים בזה אחר זה. התאם את המיקום של המיקרופיפטה המתאימה על ידי סיבוב כפתורי המניפולטורים כדי לאפשר לקצה המיקרופיפטה להתקרב לתא אחד או לחרוז. שאפו את התא או החרוז על ידי התאמת הלחץ בתוך המיקרופיפטה המתאימה. כל שלושת המיקרו-פיפטות יתפסו את האלמנטים המתאימים להם.

הסתובב בבמת מחזיק החדר כדי למצוא שטח פתוח הרחק ממושבות האלמנטים המוזרקים שם יבוצע הניסוי.

החלף את המצב החזותי של המיקרוסקופ כדי לדמיין את התמונה בתוכנית המחשב. העבר את כל שלושת האלמנטים בקצות הפיפטה לשדה הראייה של התוכנית. לאחר מכן, יישר את חרוז הבדיקה ואת ה-RBC ותמרן בזהירות את חרוז הבדיקה לקודקוד ה-RBC. כעת, תקעו לזמן קצר את החרוז על ה-RBC ונסוגו בעדינות.

כוונן את הלחץ של המיקרו-פיפטה המסייעת כדי לפוצץ בעדינות את החרוז כך שהוא יישאר מודבק על קודקוד ה-RBC. הרחיקו את המיקרו-פיפטה המסייעת, ויישרו את המטרה וחרוז הבדיקה.

בתוכנית, בחלון שדה הראייה, השתמש בכלי התוכנית כדי למדוד את הרדיוסים המתאימים של המיקרו-פיפטה של הגשושית, ה-RBC ואזור המגע המעגלי בין ה-RBC לחרוז הבדיקה. ערכים אלה מאפשרים להעריך את קבוע הקפיץ של ה-RBC על ידי המשוואה המפורטת בפרוטוקול הטקסט.

לאחר הזנת קבוע קפיץ ה-RBC הרצוי לתוכנית, צייר קו אופקי על פני קודקוד ה-RBC שיניב עקומה בחלון הסמוך המציינת את הבהירות של כל פיקסל לאורך קו זה. גררו את קו הסף כך שיהיה בערך מחצית מעומק העקומה.

לאחר מכן, בחר את מצב הניסוי הרצוי. הגדר את הפרמטרים כרצונך. לחץ על התחל המאפשר לתוכנית להזיז את פיפטת המטרה ולהניע את המטרה פנימה והחוצה ממגע עם הגשושית.

איסוף הנתונים יבוצע במקביל המתעד את מיקום חרוז הבדיקה בזמן אמת. עצור את התוכנית על ידי לחיצה על הכפתור עצור ניסוי ואז יופיע חלון כדי לאפשר שמירת הנתונים שנרכשו.