אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:05 דק׳ • July 8th, 2025
חלבונים קושרי נוקלאוטידים של גואנין - קטגוריה של GTPases - מתפקדים כמתג מולקולרי, המחזורי בין צורה פעילה הקשורה ל-GTP לצורה לא פעילה הקשורה לתמ"ג.
ה-GTPases הפעילים נקשרים לשותפים חלבונים ספציפיים. שותפים אלה מתחרים על אותו אתר מחייב ב-GTPases.
כדי לחקור כריכה תחרותית, התחל בלקיחת השעיה של GTPase הקשור ל-GTP המשותק על חרוזים מגנטיים. הוסף את שותף האינטראקציה הראשון - חלבון מתויג פלואורסצנטי A. דגירה תחת תסיסה כדי לשמור על החרוזים בתרחיף. חלבון A קושר ומרווה את אתרי הקישור בכל מולקולות GTPase.
מחלקים פתרון זה באופן שווה למספר צינורות. הוסף שותף אינטראקציה שני - חלבון B מתויג פלואורסצנטי - לצינורות בכמויות הולכות וגדלות. דגירה תחת תסיסה.
חלבון B נקשר לאותו אתר קישור ב-GTPases - מחליף באופן תחרותי את חלבון A.
חשוף את הצינורות לשדה מגנטי כדי לאסוף את החרוזים בצד אחד. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר חלבונים לא קשורים. השעו מחדש את החרוזים המורכבים בחלבון במאגר מתאים, וכימתו את החלבונים הקשורים.
שרטט את העוצמות היחסיות של חלבונים A ו-B הקשורים ל-GTPase בכל ריכוז של חלבון B.
חלבון B מגיע לשיווי משקל - תופס את אתרי הקישור של מחצית ממולקולות GTPase - בריכוז נמוך יחסית מחלבון A, מה שמעיד על זיקה גבוהה יותר של חלבון B ל-GTPase.
כדי לבצע את כריכת התחרות, הגדר שישה צינורות מיקרופוגה שכל אחד מהם מ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים