JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:05 דק' • July 8th, 2025
חלבונים קושרי נוקלאוטידים של גואנין - קטגוריה של GTPases - מתפקדים כמתג מולקולרי, המחזורי בין צורה פעילה הקשורה ל-GTP לצורה לא פעילה הקשורה לתמ"ג.
ה-GTPases הפעילים נקשרים לשותפים חלבונים ספציפיים. שותפים אלה מתחרים על אותו אתר מחייב ב-GTPases.
כדי לחקור כריכה תחרותית, התחל בלקיחת השעיה של GTPase הקשור ל-GTP המשותק על חרוזים מגנטיים. הוסף את שותף האינטראקציה הראשון - חלבון מתויג פלואורסצנטי A. דגירה תחת תסיסה כדי לשמור על החרוזים בתרחיף. חלבון A קושר ומרווה את אתרי הקישור בכל מולקולות GTPase.
מחלקים פתרון זה באופן שווה למספר צינורות. הוסף שותף אינטראקציה שני - חלבון B מתויג פלואורסצנטי - לצינורות בכמויות הולכות וגדלות. דגירה תחת תסיסה.
חלבון B נקשר לאותו אתר קישור ב-GTPases - מחליף באופן תחרותי את חלבון A.
חשוף את הצינורות לשדה מגנטי כדי לאסוף את החרוזים בצד אחד. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר חלבונים לא קשורים. השעו מחדש את החרוזים המורכבים בחלבון במאגר מתאים, וכימתו את החלבונים הקשורים.
שרטט את העוצמות היחסיות של חלבונים A ו-B הקשורים ל-GTPase בכל ריכוז של חלבון B.
חלבון B מגיע לשיווי משקל - תופס את אתרי הקישור של מחצית ממולקולות GTPase - בריכוז נמוך יחסית מחלבון A, מה שמעיד על זיקה גבוהה יותר של חלבון B ל-GTPase.
כדי לבצע את כריכת התחרות, הגדר שישה צינורות מיקרופוגה שכל אחד מהם מכיל 200 מיקרוליטר של מאגר כריכת תחרות. כל צינור צריך להכיל גם 10 מיקרוליטר של חרוזי Rac1 טעוני נוקלאוטידים וחמישה מיקרוליטרים של חלבון קושר Rac1 A כחלבון קושר קבוע.
לכל צינור, הוסף 0, 1, 2.5, 5, 10 או 20 מיקרוליטר של חלבון קושר Rac1 B כחלבון הקושר המשתנה. נפחים אלה מניחים ריכוזי מלאי שווים בערך של חלבוני הקישור הקבועים והמשתנים וייתכן שיהיה צורך להתאים אותם.
הרכיבו את הנפח הכולל של תערובת הכריכה ל-235 מיקרוליטר על ידי תוספת של מאגר הכריכה התחרותי. לאחר מכן, הקימו צינור מיקרופוגה המכיל 200 מיקרוליטר של מאגר התחרות, 10 מיקרוליטר של חרוזי Rac1 ניסיוניים טעוני נוקלאוטידים ו-10 מיקרוליטר של חלבון A קושר Rac1.
לאחר מכן, הגדר את התמ"ג, GTPγS וללא צינורות בקרת נוקלאוטידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דוגרים את הצינורות למשך שעתיים, מערבבים בהיפוך ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם מאגר כריכת התחרות.
לבסוף, יש להוציא את החלבונים הקשורים ב-20 מיקרוליטר של מאגר דגימה מפחית.