מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

מונומרים של אקטין מתפלמרים בצורה מכף רגל ועד ראש ליצירת סיבים דקים, הנקראים מיקרו-פילמנטים. באופן דומה, דימרים של טובולין מתפלמרים למיקרו-צינורות גליליים חלולים ארוכים יותר. רכיבי שלד תאים אלה שומרים על צורת התא ומקלים על תנועתיות התא.

כדי לדמיין את דינמיקת הצימוד של אקטין-מיקרו-צינוריות על ידי מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל, TIRF, קח מכלול הדמיה מותאם אישית.

מכלול ההדמיה מורכב משני כיסויים: כיסוי עליון מצופה סילאן m-PEG וכיסוי תחתון מצופה סילאן ביוטין-PEG. שני הכיסויים מרווחים לאורך עם סרט דבק דו צדדי ואטומים בשני הקצוות ליצירת תעלת זרימה.

פיפטה BSA לתוך תעלת הזרימה כדי לקדם את החדר. מוסיפים תמיסת סטרפטווידין ודוגרים. מולקולות הסטרפטווידין נקשרות למולקולות הביוטין המחוברות ל-PEG-silane של הכיסוי התחתון.

הזרמת מאגר TIRF לתעלה. הוסף תמיסת תערובת שלד ציטו המכילה דימרים טובולינים ללא תווית וירוקים עם תווית פלואורופור, יחד עם מונומרים אקטין ללא תווית, מסומנים בביוטין וסגולים עם תיוג פלואורופור.

לאחר מכן, הוסף תמיסת תגובה המכילה ATP - חומר מקדם פילמור אקטין, ו- GTP - חומר מקדם פילמור טובולין, וחלבון צימוד אקטין-מיקרו-צינורות. דגירה.

דימרי הטובולין נקשרים למולקולות ה-GTP ומתפלמרים, בעוד שמונומרי האקטין נקשרים למולקולות ה-ATP ומתפלמרים ליצירת מיקרו-צינורות ומיקרו-פילמנטים, בהתאמה.

הנח את מכלול ההדמיה מתחת למיקרוסקופ TIRF. לעורר את הפלואורופורים עם לייזרים באורכי גל מתאימים.

אור העירור משתקף פנימית, ויוצר שדה אור המאיר באופן סלקטיבי את הפלואורופורים באזור מוגבל ליד ממשק הזכוכית-מים, שבו יש שתי מדיות עם מקדמי שבירה שונים. באזור זה, המיקרו-פילמנטים נראים סגולים, והמיקרו-צינורות נראים ירוקים.

חותכים 12 רצועות של סרט דו צדדי בעל גב כפול, לאורך של 24 מילימטרים. הסר צד אחד של גב הסרט וקבע פיסות סרט בסמוך לששת החריצים הקיימים בתא הדמיה נקי. הסר את החלק השני של גב הסרט, כדי לחשוף את הצד הדביק של הסרט לאורך כל חריץ בתא, והנח את החדר, עם צד הסרט כלפי מעלה, על משטח נקי.

מערבבים שרף אפוקסי ותמיסות מקשה, אחד לאחד בסירת משקל קטנה, ומשתמשים בקצה P1000 כדי להניח טיפה של אפוקסי מעורבב בין רצועות הסרט בקצה כל חריץ תא הדמיה. לאחר מכן, הנח סרט תא, או צד אפוקסי כלפי מעלה, על משטח נקי.

הסר כיסוי מצופה מאינקובטור 70 מעלות צלזיוס, ושטוף את המשטחים המצופים והלא מצופים של הכיסויים במים מזוקקים כפולים שש פעמים. יבש עם גז חנקן מסונן, ולאחר מכן הדבק לתא ההדמיה, כשצד ציפוי הכיסוי לכיוון הסרט.

השתמש בקצה פיפטה P200 או P1000 כדי להפעיל לחץ על ממשק הסרט-זכוכית, כדי להבטיח אטימה טובה בין הסרט לכיסוי. דגרו את התאים המורכבים בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות לפחות, כדי לאפשר לאפוקסי לאטום לחלוטין את קירות החדר לפני השימוש.

תאי הזלוף פגים תוך 12 עד 18 שעות מההרכבה. השתמש במשאבת זלוף, והחלף ברצף תמיסות מיזוג בתא הזלוף על ידי הזרמת 50 מיקרוליטר של 1% BSA כדי לטשטש את תא ההדמיה.

הסר את המאגר העודף ממאגר ההתאמה של Luer-lock. לאחר מכן, זרמו 50 מיקרוליטר של 0.005 מיליגרם למיליליטר סטרפטווידין, ודגרו במשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר. הסר את המאגר העודף מהמאגר.

הזרימו 50 מיקרוליטר של 1% BSA כדי לחסום את הקישור הלא ספציפי, ודגרו למשך 10 עד 30 שניות. הסר את המאגר העודף מהמאגר. לאחר מכן, הזרימו 50 מיקרוליטר של מאגר TIRF חם 1x, ולאחר מכן 50 מיקרוליטר של זרעי מיקרו-צינורות מיוצבים ו-50% ביוטיניליים, מדוללים במאגר TIRF 1x.

הגדר את ה-tagאו מכשיר החימום האובייקטיבי לשמירה על טמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לפני הדמיית התגובה הביוכימית הראשונה. לאחר מכן, הגדר את מרווח הרכישה לכל חמש שניות, למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, הגדר את חשיפות הלייזר 488 ו-647 ל-50 עד 100 אלפיות השנייה בהספק של 5% עד 10%, על ידי התאמת תגובת הפילמור תחילה כדי להתחיל את מכלול חוטי האקטין.

רכוש את התמונות ב-647 ננומטר, ובצע התאמות מתאימות. לאחר מכן, התאם את תגובת הפילמור בבאר זלוף מותנית שנייה, כדי להתחיל את מכלול המיקרו-צינוריות. דמיין ב-488 ננומטר, ובצע התאמות מתאימות.

שלב שלושה מיקרוליטר של 10 מיקרומולרי 488 טובולין עם 7.2 מיקרוליטר של 100 טובולין מיקרומולר ללא תווית, לא יותר מ-15 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, שלבו שלושה מיקרוליטרים של אקטין ביוטיניל מדולל בנפחים מתאימים של אקטין ללא תווית ומסומן פלואורסצנטית, כך שהתערובת הסופית תהיה 12.5 מיקרו-מולרי אקטין כולל, עם תווית פלואורסצנטית של 10% עד 30%.

הכן את תערובת השלד הציטולוגי על ידי שילוב של שני מיקרוליטרים של מלאי תערובת האקטין של 12.5 מיקרומולרית עם תערובת ציר הטובולין, לא יותר מ-15 דקות לפני ההדמיה. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.

הכן את תערובת תגובת החלבון על ידי שילוב של כל שאר רכיבי הניסוי והחלבונים, כולל 2x מאגר TIRF, אנטי אקונומיקה, נוקלאוטידים, מאגרים וחלבונים נלווים. דגרו את תערובת השלד הציטולוגי בתערובת תגובת החלבון בנפרד, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 שניות.

כדי ליזום את התגובה, הוסיפו את התוכן של תערובת תגובת החלבון לתערובת השלד הציטוטי, וערבבו אותה. זרימה של 50 מיקרוליטר מתערובת התגובה המכילה 1x מאגר TIRF בתוספת 15 טובולין חופשי מיקרומולרי, GTP מילימולרי אחד, 0.5 מונומרים אקטין מיקרומולרי, ונפחים מתאימים של בקרות חיץ לתא הזלוף.

הקלט סרט דולג זמן באמצעות תוכנת מיקרוסקופ, כדי לרכוש כל חמש שניות, למשך 15 עד 20 דקות. התנה באר זלוף חדשה, והחלף את נפח החיץ בחלבון הרגולטורי המעניין ובקרות החיץ. לרכוש כדי להעריך את החלבונים הרגולטוריים לתפקודי מיקרו-צינורות אקטין מתהווים.