מיקרוסקופ גיליון אור סריג כדי להמחיש אינטראקציות קולטן-ליגנד בתאים חיים

מיקרוסקופ יריעות אור סריג, LLSM, מאפשר הדמיה של אינטראקציות קולטן-ליגנד על פני התא בתאים חיים עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

קח כיסוי המכיל תאים המבטאים ליגנד מותמרים הפולטים פלואורסצנטיות אדומה. חבר את תא הכיסוי כלפי מעלה על מחזיק דגימה משומן. קבע את המחזיק על הפיזו של שלב מיקרוסקופ כדי לאפשר מיקום וסריקה מדויקים של הדגימה במהלך ההדמיה. התאם את הגדרות התוכנה כדי להתמקד בתא יחיד המבטא ליגנד.

העבר את מתלה התא המבטא קולטן על הכיסוי. הקולטנים מתויגים בנוגדנים ירוקים המסומנים בפלואורופור. דמיין את זוגות התאים המקיימים אינטראקציה.

לייזר העירור של המיקרוסקופ פולט קרן לייזר מעגלית מקוטבת ליניארית העוברת דרך עדשות גליליות ליצירת יריעת אור. יריעת האור מוקרנת על גבי מאפנן שמסיר עקיפה עודפת והופך אותה לתבנית סריג דקה במיוחד.

יריעת אור הסריג מאירה קטע דק במיוחד של זוג התאים המקיים אינטראקציה, והפלואורסצנציה הנפלטת מהתאים המקיימים אינטראקציה נלכדת בניצב לקרן האירוע. צלם את זוג התאים המקיימים אינטראקציה במספר מישורי Z, וצלם תמונות דו-ממדיות בכל מישור מוקד עם מצלמה מהירה.

באמצעות תוכנה מתאימה, שלבו את התמונות הללו ליצירת z-stack - תמונה ארבע-ממדית ברזולוציה גבוהה המדגימה את הדינמיקה המרחבית-זמנית של האינטראקציה בין הקולטן לליגנד על פני התא.

הוסף 10 מיליליטר מים ו -30 מיקרוליטר פלואורסצאין לאמבט LLSM. ראשית, לחץ על תמונה (בית) כדי להזיז את האובייקט למיקום תמונה, והסתכל על דפוס קרן לייזר של כלי יחיד.

יישר את קרן הלייזר באמצעות המדריך ואזור העניין המוגדר מראש כדי להפוך את הקרן לדפוס דק המאוזן לכל הכיוונים. הקרן צריכה להיראות ממוקדת גם במצלמת המוצא. השתמש בשני מכווני הטיית המראה, במיקרומטר המיקוד העליון ובצבע המטרה כדי לכוונן את האלומה.

לאחר מכן, שטפו את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 מיליליטר מים כדי להסיר לחלוטין כל פלואורסצאין.

כדי לצלם חרוזי פלואורסצנט סטנדרטיים, הפעל את Dither על ידי הגדרה ל-3 בתיבה 'X Galvo Range' ולחץ על Live כדי להציג את השדה הנוכחי. כוונן ידנית את מראה ההטיה, צבע המטרה ומיקרומטר המיקוד לערכי האפור הגבוהים ביותר. לאחר מכן, התאם לפי הצורך כדי לקבל דפוסים מתאימים עבור סריקת אובייקטיביות, Z galvo, Z פלוס אובייקטיבי, ומצבי לכידת סריקת דגימה. לאחר מכן, לחץ על ביצוע במצב סריקה לדוגמה כדי לאסוף את פונקציית התפשטות נקודת הדגימה לביטול הטיה ודה-קונבולוציה. שנה את מדפסות הלייזר למצב שלושה צבעים ולחץ שוב על ביצוע.

כדי להתחיל, הוסף 100,000 תאים מציגי אנטיגן לכיסוי העגול המוכן בקוטר 5 מילימטר, ואפשר להם להתיישב במשך 10 דקות. יש לשמן את מחזיק הדגימה ולהוסיף אליו את הכיסוי בצד התא כלפי מעלה.

לאחר מכן, הוסף טיפה של מדיית הדמיה לחלק האחורי של הכיסוי. הברג את מחזיק המדגם על הפיזו ולחץ על תמונה (בית). מצא תא המציג אנטיגן לתמונה וודא שה-LLSM ותוכנת ההדמיה פועלות כראוי.

לחץ על Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. עבור לאורך Z כדי למצוא את הכיסוי והתאים. מצא את מרכז התא המציג אנטיגן על ידי תנועה בכיוון Z, ולאחר מכן, לחץ על עצור כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת מימד והזן את ההגדרות הרצויות. לחץ על Enter ולאחר מכן לחץ על Execute כדי לאסוף את הנתונים.

הורד את ה-stagה למצב עומס, והוסף 50 מיקרוליטר של תאי T במדיית הדמיה, ישירות מעל הכיסוי. עדיף לתת לטיפה להיווצר בקצה קצה הפיפטה ולאחר מכן, לגעת בקצה לנוזל האמבטיה. הרם את הבמה לאחור על ידי לחיצה על תמונה (חזרה).

התחל לדמיין. הקפד להגדיר את ה-Z-stack ואת אורך ה-Timelapse הרצויים. לדוגמה, תמונה 60 Z-stacks בגודל צעד של 0.4 מיקרומטר והזנת מסגרות זמן 500. הפסק להקליט לפני שמגיעים ל-500 פריימים כדי למנוע הלבנת אור. השתמש במצב Live כדי לחפש זוגות תאים, וכאשר הוזנו ההגדרות המוכנות והרצויות, לחץ על Execute כדי לאסוף נתונים.