מיקרוסקופ השתקפות הפרעות להדמיה ללא תוויות של דינמיקה של מיקרוטובולים

מיקרוסקופ השתקפות הפרעות מאפשר הדמיה של מיקרו-צינורות הגדלים ומתכווצים באופן דינמי.

תקן רצועות פרפין על כיסוי אחד והניח כיסוי מעט קטן יותר מעל. מחממים להמסת הפרפין ויוצרים תעלה אטומה. פיפטה תמיסה המכילה נוגדנים דרך התעלה. הנוגדנים נצמדים למשטח הכיסוי. הוסף תמיסת חסימה, חוסמת את האזורים הלא קשורים לנוגדנים ומונעת קשירת חלבון לא ספציפית.

הנח את הכיסוי על המיקרוסקופtage. הגדר את מחמם הדגימה לטמפרטורה המאפשרת צמיחת מיקרו-צינורות.

זרעי מיקרו-צינורות פיפטה מיוצבים עם גואנוזין טריפוספט שאינו ניתן להידרוליזה, GTP, אנלוגי. הזרעים נקשרים לכיסוי המצופה נוגדנים. הוסף מאגר המכיל טובולין ללא תווית, GTP וחומרי הפחתה.

בתנאי טמפרטורה וחצץ אופטימליים, הזרעים פועלים כאתרי גרעין, ומאפשרים קשירת טובולין ללא תווית וצמיחת מיקרו-צינוריות.

התחל לדמיין. האור הפוגע מתמקד דרך דיאפרגמת צמצם על מפצל אלומה המחזיר חלקית את האור למטרה, ומאיר את הדגימה. ממשק חיץ הזכוכית של הכיסוי משקף חלקית את האור הפוגע. האור הנותר עובר ומשתקף בממשקי המאגר-מיקרו-צינוריות.

בהתבסס על מרחק ההחלקה של המיקרו-צינוריות, הקרניים המוחזרות משני הממשקים מפריעות, ויוצרות הפרעות בונות - אלומות המשתלבות ליצירת אות בהיר, או הפרעות הרסניות - אלומות מתבטלות כדי לייצר אות כהה.

דמיין את המיקרו-צינורות כתמונות בעלות ניגודיות גבוהה. צלם תמונות דולג זמן, זיהוי צמיחה והתכווצות של מיקרו-צינורות.

כדי להתחיל, הכנס מראה 50/50 לגלגל המסנן של מיקרוסקופ פלורסנט באמצעות קוביית סינון מתאימה. טפל במראה בזהירות מכיוון שלעתים קרובות יש להם ציפוי נגד השתקפות. פנה למטרה בהגדלה גבוהה שיש לה גם צמצם מספרי גבוה. זה שמוצג כאן הוא אובייקט שמן פי 100 עם צמצם מספרי של 1.3.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח ובשקופית מיקרוסקופ כקצה ישר כדי לחתוך רצועות ברוחב 3 מילימטר של סרט פרפין מפלסטיק. הנח שתיים מרצועות סרט הפרפין מפלסטיק במרחק של 3 מילימטרים זו מזו על כיסוי נקי בגודל 22 על 22 מילימטר. לאחר מכן, הנח כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר על גבי הרצועות ליצירת תעלה.

העבירו את הכיסוי לגוש חום בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 שניות כדי שסרט הפרפין ייצור תעלה אטומה. בעזרת פיפטה, הזרימו 50 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן נגד רודמין על ידי זילוף, ודגרו על המגלשה למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה יש לשטוף את התעלה חמש פעמים באמצעות BRB80 מסונן. לאחר מכן, זרמו 1% פולוקסמר 407 ב-BRB80 המסונן כדי לחסום את פני השטח מפני קשירה לא ספציפית, ודגרו על המגלשה למשך 10 דקות. שוב, שטפו את התעלה חמש פעמים באמצעות BRB80 מסונן.

כדי למנוע את התייבשות הדגימה, הוסף שתי טיפות של BRB80 המסונן בקצות התעלה והוסף עוד מאגר לפי הצורך. הנח את הדגימה על המיקרוסקופ stage והפעל את מקור האור epi-illumination. התמקד בקצה סרט הפרפין כדי למצוא את משטח הדגימה, ולאחר מכן, הזז את השדה כדי להגדיר את התצוגה למרכז החדר. תוכלו לצפות במספר משטחים כאשר המטרה מועברת למעלה ולמטה עקב השתקפות אחורית של אור מאופטיקה בתוך הנתיב האופטי.

לאחר מכן, מרכז את דיאפרגמת השדה בשדה הראייה על ידי סגירתה באמצע הדרך ושימוש בברגי הכוונון לאחר שהדיאפרגמה מיושרת כהלכה, פתח אותה מחדש. לאחר מכן, החלק פנימה את עדשת ברטרנד כדי לראות את מישור המוקד האחורי, הידוע גם כאישון היציאה של המטרה.

סגור את דיאפרגמת הצמצם מעבר לקצוות אישון היציאה, והשתמש בברגי הכוונון כדי למרכז את דיאפרגמת הצמצם ביחס לאישון היציאה. בדוק שוב על ידי פתיחת דיאפרגמת הצמצם והתאמת הקצוות שלה לאלה של אישון היציאה. לאחר מכן, הגדר את דיאפרגמת הצמצם לכ-2/3 מהצמצם המספרי של המטרה.

כדי לדמות דינמיקה של מיקרו-צינורות באמצעות טובולין מוח, התחל בהגדרת טמפרטורת מחמם הדגימה ל-37 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה, זרמו פנימה 10 מיקרוליטר של זרעי מיקרו-צינורות מיוצבים GMPCPP, ועקבו אחר קשירתם לפני השטח על ידי הדמיית פני השטח חיים. לאחר ש-10 עד 20 זרעים נקשרים בשדה הראייה, שטפו את הדגימה באמצעות נפח כפול של התעלה של BRB80 מחומם ומסונן.

לאחר מכן, זרמו פנימה 10 מיקרוליטר מתערובת הפילמור.

כדי למדוד את צמיחת המיקרו-צינוריות, הגדר זמן-lapse באמצעות תוכנת הרכישה כדי לרכוש תמונה כל 5 שניות למשך 15 דקות. שפר את הניגודיות על-ידי השגת תמונה ממוצעת של 10 בכל נקודת זמן. רכוש תמונות רקע כפי שמוצג בסעיף הקודם. חשב את החציון על ידי מעבר אל תמונה, בחירה בערימה, לאחר מכן פרויקט Z ולאחר מכן חציון. הפחיתו את הרקע המתאים על ידי מעבר אל תהליך, מעבר אל מחשבון תמונות ובחירה באפשרות החסר מהתפריט הנפתח. ודא שאפשרות תוצאת הציפה של 32 סיביות מסומנת.

להתכווצות מיקרו-צינוריות, רכוש תמונות ב-100 פריימים לשנייה על ידי הגדרת עיכוב הזמן לאפס ושמירה על זמן החשיפה על 10 אלפיות השנייה.