Why does electrostatic binding matter for nucleosome deposition?

Electrostatic binding between negatively charged DNA and positively charged APS-functionalized mica ensures stable nucleosome attachment during imaging. This interaction prevents sample displacement and supports consistent topographic data acquisition. Proper charge interaction is essential for reproducible nucleosome visualization.

How does APS concentration affect mica surface preparation?

APS concentration determines the density of amine groups on the mica surface, influencing its positive charge and nucleosome binding capacity. The protocol specifies a working solution derived from 50 mM APS stock diluted in deionized water to optimize surface functionalization. Deviations may lead to overcrowding or poor nucleosome adhesion.

What does constant cantilever deflection enable during AFM scanning?

Maintaining constant cantilever deflection via the feedback loop allows accurate topographic mapping of nucleosome surfaces by adjusting vertical scanner position in real time. This ensures consistent tip-sample interaction force across the scan area. The resulting signal generates high-resolution images showing nucleosome cores as bright blobs with flanking DNA arms.

Why is rinsing with deionized water necessary after nucleosome deposition?

Rinsing removes unbound buffer components such as HEPES and magnesium chloride that could interfere with AFM imaging or cause crystalline artifacts. This step reduces background noise and improves signal-to-noise ratio in topographic data. It is performed gently to avoid displacing bound nucleosomes from the mica surface.

How does scan size adjustment impact nucleosome imaging resolution?

Increasing scan size from 100x100 nm to 1x1 μm allows visualization of larger fields containing multiple nucleosomes while maintaining 512x512 pixel resolution. This adjustment enables statistical analysis of nucleosome distribution and morphology across a broader sample area. The transition is made after initial tip engagement and amplitude optimization to ensure image clarity.

מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי להדמיה ואפיון של נוקלאוזומים מורכבים

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 5:09 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוקלאוזומים, היחידה הבסיסית החוזרת של כרומטין אוקריוטי, מורכבים מסיבובי DNA העטופים סביב ליבה של חלבוני היסטון.

כדי לדמיין נוקלאוזומים מורכבים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי, AFM, התחל ברצועת נציץ דקה, מתפקדת כדי להפוך את פני השטח לבעלי מטען חיובי. חותכים את הרצועה לריבועים קטנים. פיפטה מתלה נוקלאוזום מורכב.

ה-DNA הטעון שלילית בנוקלאוזום נקשר לקבוצה הטעונה חיובית של רצועת הנציץ המתפקדת באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות. יש לשטוף עם חיץ כדי למנוע צפיפות יתר של נוקלאוזומים.

אבטח את רצועת הנציץ על דיסק תמיכה בדגימה. התקן אותו על מכשיר ה-AFM stage.

חבר את מחזיק הבדיקה לראש האופטי של המכשיר. המחזיק מכיל שלוחת AFM מותקנת מראש עם קצה בקודקודו.

יישר את קרן הלייזר על גב השלוחה למדידת סטייה מדויקת. מקם את הקצה במגע ישיר עם המשטח המכיל נוקלאוזום.

במהלך הדמיית מצב מגע, כאשר קצה השלוחה סורק על פני השטח של הנוקלאוזום, נוצרים כוחות דוחים בעקבות אינטראקציות בין אטומי הקצה והדגימה. זה גורם לשלוחה להתכופף. קרן הלייזר מוחזרת בצורה שונה ומכוונת לגלאי הצילום הרגיש למיקום.

לולאת המשוב שומרת על סטיית שלוחה קבועה על ידי תנועת הסורק האנכית במהלך הסריקה. אות משוב זה משמש עוד ליצירת תמונות נוקלאוזום טופוגרפיות. ליבת הנוקלאוזום נראית ככתמים בהירים, עם זרועות דקות המייצגות את ה-DNA האגפי.

הכן את משטח הנציץ להדמיית AFM סטטית. לשם כך, הכינו תחילה תמיסת מלאי APS של 50 מילי-מולרית במים נטולי יונים. אחסן 1 מיליליטר מהתמיסה בחום של 4 מעלות צלזיוס, עד שיהיה צורך בה.

מתמיסת המלאי, הכינו תמיסת APS עובדת לשינוי נציץ על ידי המסת 50 מיקרוליטר ממלאי ה-APS של 50 מילי-מולר ב-15 מיליליטר של מים מזוקקים נטולי יונים. מערבבים את התמיסה ואז ממלאים קובטה בתמיסה.

לאחר מכן, חותכים רצועות נציץ בגודל 1 על 3 סנטימטר מגיליונות נציץ איכותיים. בדוק שהיצירה מתאימה כאשר היא מונחת באלכסון בקובטה. לאחר מכן, חתכו שכבות של הנציץ עד ששני הצדדים נבקעו טריים והחתיכה דקה עד 0.1 מילימטר.

הכניסו מיד את חתיכת הנציץ לקובטה המלאה ב-APS, ודגרו על הנציץ למשך 30 דקות. מעבירים את חתיכת הנציץ לקובטה מלאה במים מזוקקים דה-יונים ומשרים אותה למשך 30 שניות. לאחר מכן, השתמש בארגון כדי לייבש לחלוטין את שני הצדדים של רצועת APS-mica.

מרחו סרט דבק דו-פרצופי על מספר דיסקיות מגנטיות, והניחו אותם בצד. לאחר מכן, חותכים את מצע ה-APS-mica לריבועים של 1 סנטימטר על 1 סנטימטר ומכסים אותם בצלחת פטרי נקייה. לאחר מכן, הכינו שלושה דילולים של הנוקלאוזומים המורכבים באמצעות מאגר מסונן של 0.22 מיקרון המכיל HEPES של 10 מילי-מולרית ומגנזיום כלוריד של 4 מילי-מולרי ב-pH של 7.5.

כדי להגביל את אובדן הנוקלאוזומים בריכוז הסופי הנמוך, יש לבצע את הדילול בזה אחר זה, מיד לפני התצהיר על ה-APS-mica.

הפקידו 5 עד 10 מיקרוליטר מכל דגימת נוקלאוזום במרכז חתיכת APS-נציץ, ותנו להם לדגור במשך 2 דקות. לאחר מכן, שטפו בעדינות את הדגימה עם 2 עד 3 מיליליטר מים מזוקקים דה-יונים כדי להסיר את רכיבי החיץ, וייבשו את הדגימה המופקדת תחת זרימה קלה של ארגון.

כדי להתחיל, התקן קצה על מחזיק הקצה של מערך AFM. לאחר מכן, הרכיב את הדגימה הראשונה על ה-AFM tagה, היזהר לא לגעת במשטח הדגימה. מקם את הלייזר מעל השלוחה עד שסכומו יהיה במקסימום והתאם את ערכי הסטייה האנכית והרוחבית לקרוב ל-0. לאחר מכן, כוון את בדיקת ה-AFM כדי למצוא את תדר התהודה שלה. כוונן את משרעת הכונן והגדר את גודל התמונה ל-100 על 100 ננומטר. לאחר ההגדרה, לחץ על כפתור Engage כדי להתחיל בגישה.

לאחר השלמת הגישה, בצע אופטימיזציה הדרגתית של נקודת ההגדרה של המשרעת עד שפני השטח של הדגימה נראים בבירור. לאחר מכן, הגדל את גודל הסריקה ל-1 מיקרון על 1 מיקרון ואת הרזולוציה ל-512 על 512 פיקסלים. לבסוף, לחץ על ללכוד כפתור כדי להתחיל ברכישת תמונות.