מיקרוסקופ כוח אטומי בהילוך מהיר ללכידת דינמיקה של נוקלאוזומים

נוקלאוזומים - יחידות חוזרות של DNA אוקריוטי - מורכבים מקטעי DNA העטופים סביב ליבות חלבון היסטון. התרת DNA סביב ליבת ההיסטון חיונית לדינמיקה של נוקלאוזום.

כדי ללכוד דינמיקת נוקלאוזום, התחל עם מצע נציץ חלק ופונקציונלי המותקן על מיקרוסקופ כוח אטומי, AFM, שלב סורק. שכבו את המצע עם מאגר המכיל נוקלאוזום.

ה- DNA הנוקלאוזום הטעון שלילית מקיים אינטראקציה עם מטענים חיוביים על הנציץ הפונקציונלי, ומשתק אותם על פני השטח. שטפו את מצע הנציץ המשותק עם חיץ כדי למנוע צפיפות יתר של הנוקלאוזומים.

העבירו את שלב הסורק המכיל נוקלאוזום לתא הדמיה המכיל שלוחה מותקן מראש, עם קצה בקצה ופונה כלפי מעלה לכיוון הנוקלאוזומים.

מלא את החדר במאגר הדמיה. יישר את קרן הלייזר על גב השלוחה כדי להבטיח מדידות סטייה מדויקות.

קצה ה-AFM מתנודד קרוב לנוקלאוזומים העטופים במלואם וסורק על פני השטח כדי למדוד את גובה הנוקלאוזומים במרווחי זמן קבועים.

פתיחת DNA ספונטנית מגדילה את גובה הנוקלאוזום, מחליפה את תנודות הקצה ומובילה לסטייה של שלוחה. סטיית שלוחה זו משנה את מיקום קרן הלייזר המוחזרת, המזוהה על ידי גלאי רגיש למיקום ומייצר תמונות נוקלאוזום טופוגרפיות.

בתמונות AFM, ליבת ההיסטון מופיעה ככתם זוהר עם DNA לא עטוף בגבהים הולכים וגדלים עם הזמן, המעיד על דינמיקה של נוקלאוזום.

השתמש בדבק סורק מוט זכוכית כדי לחבר מוט זכוכית לסורק AFMTAGה. הניחו לתערובת להתייבש למשך 10 דקות לפחות. בינתיים, הכינו חתיכות נציץ עגולות בעובי 0.1 מילימטר בקוטר 1.5 מילימטר על ידי ניקובם מגיליון נציץ גדול יותר. השתמש בדבק מוט זכוכית נציץ AFM במהירות גבוהה כדי לחבר את חתיכת הנציץ הזו למוט הזכוכית במהירות גבוהה-AFM, ולאפשר לה להישאר ללא מגע למשך 10 דקות לפחות בזמן שהיא מתייבשת.

לאחר מכן, חתכו שכבות מהנציץ באמצעות סרט רגיש ללחץ עד שנראה שכבה שסועה היטב על הסרט. לאחר מכן, יש לדלל 1 מיקרוליטר של מלאי APS של 50 מילי-מולרית ב-99 מיקרוליטר של מים מזוקקים דה-יונים כדי ליצור תמיסת APS של 500 מיקרו-מולאר. הפקידו 2.5 מיקרוליטר מהתמיסה על משטח הנציץ הטרי, ותנו למשטח לתפקד למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה יש לשטוף את הנציץ מספר פעמים במים מזוקקים נטולי יונים על ידי מריחת שטיפות של 3 מיקרוליטר. הסר את המים לחלוטין לאחר כל שטיפה על ידי הנחת מגבון לא ארוג בקצה הנציץ. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו 3 מיקרוליטר של מים מזוקקים נטולי יונים על פני השטח, ותנו להם לשבת לפחות 5 דקות כדי להסיר כל APS שאינו קשור במיוחד.

לאחר מכן, הנח את הגשושית במחזיק ה-AFM המהיר, ומקם את המחזיק על ה-AFMTAGה כשהקצה פונה כלפי מעלה. שטפו את המחזיק באמצעות 100 מיקרוליטר מים מזוקקים נטולי יונים, ולאחר מכן שתי שטיפות של 100 מיקרוליטר של מאגר הדמיית נוקלאוזום מסוננת של 0.22 מיקרון. לאחר סיום השטיפה, מלאו את התא ב-100 מיקרוליטר של מאגר הדמיית נוקלאוזום, והטבילו את הקצה.

כוונן את מיקום השלוחה עד לפגיעה בלייזר. לאחר מכן, שטפו את ה-APS-mica חמש פעמים עם מאגר הדמיית נוקלאוזום מסונן, תוך שימוש ב-4 מיקרוליטר לשטיפה. לדלל 1 מיקרוליטר ממלאי מכלול הנוקלאוזום ל-250 מיקרוליטר של מאגר הדמיית נוקלאוזום מסונן לריכוז נוקלאוזום סופי של 1 ננו-מולר.

הפקידו 2.5 מיקרוליטר מדילול זה על פני השטח, ותנו לו לשבת במשך 2 דקות. שטפו את המשטח פעמיים עם 4 מיקרוליטר של מאגר הדמיית נוקלאוזום כדי למנוע צפיפות. לאחר השטיפה האחרונה, השאר את המשטח מכוסה במאגר הדמיה. הנח את הסורק והדגימה על גבי מחזיק הקצה כך שהדגימה תהיה עם הפנים כלפי מטה.

כדי להתחיל בגישה, השתמש בפונקציית הגישה האוטומטית עם משרעת נקודת הגדרה קרובה למשרעת התנודה החופשית. כוונן את נקודת ההגדרה עד שהמשטח נמצא במעקב טוב. לאחר מכן, הגדר את אזור התמונה סביב 150 על 150 ננומטר ל-200 על 200 ננומטר עם קצב רכישת נתונים של כ-300 אלפיות השנייה לכל מסגרת הדמיה.