מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת לכימות התפלגות הגליקוגן בשרירי השלד האנושיים

גליקוגן, פולימר גלוקוז מסועף, הוא עתודת אנרגיה בתאים בין-תאיים, אינטרמיופיברילריים ותת-סרקולמליים בתוך שריר השלד האנושי.

כדי לכמת את התפלגות הגליקוגן התת-תאית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, TEM, השג רקמת שריר שלד אנושית מבודדת. יש לתקן עם גלוטראלדהיד כדי לשמר את מבנה הרקמות. לאחר תיקון הרקמה בתמיסת אוסמיום טטרוקסיד ואשלגן פרוציאניד.

קומפלקס האוסמיום-פרוציאניד המופחת נקשר לקבוצות ההידרוקסיל בגליקוגן, ומשפר את הניגודיות של חלקיקי הגליקוגן בשריר. בנוסף, ממברנות ורטיקולום סרקופלזמי - אברון הקשור לממברנה - מוכתמים.

לייבש את הרקמה בהגדלת ריכוזי האתנול. מוטבע בשרף ויוצר גוש מוצק. השג קטעים דקים במיוחד עם סיבי שריר מכוונים לאורך; העברה לרשתות TEM.

טבלו את הרשתות בתמיסת אורניל אצטט, מתכת כבדה. יוני אורניל נקשרים לליפידים וחלבונים בעלי מטען שלילי, מה שהופך אותם לדחוסי אלקטרונים. כתם עם תמיסת ציטראט עופרת.

יוני עופרת נקשרים לאזורים המוכתמים באוסמיום, כולל חלקיקי הגליקוגן, מה שמשפר את הניגודיות. הם גם נקשרים לאזורים המגיבים לאורניל אצטט, ומגבירים את אטימות האלקטרונים.

במהלך הדמיית TEM, כאשר קרני אלקטרונים עוברות דרך הרקמה, אזורים מוכתמים צפופים באלקטרונים, כולל גליקוגן, מפזרים יותר אלקטרונים, בעוד שאזורים לא מוכתמים מעבירים אלקטרונים.

בתמונת TEM בעלת הניגודיות הגבוהה שנוצרה, חלקיקי הגליקוגן נראים מובחנים וכהים; אזורים לא מוכתמים נראים בהירים יותר, מה שמקל על הדמיה וכימות של התפלגות הגליקוגן התת-תאית בשריר.

בודד דגימה קטנה מביופסיית השריר או מהשריר השלם, שקוטרו המרבי של מילימטר אחד לכל כיוון, והוא ארוך יותר לאורך מאשר בחתך.

הנח את הדגימה בצינור המכיל את תמיסת הקיבוע הראשונית הקרה. אחסן אותו בטמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, שטפו את הדגימה 4 פעמים במאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולארי. בעזרת פיפטות העברה, הסר את המאגר המשומש מהצינור, השאר את הדגימה ללא מגע, והוסף את המאגר הטרי. לאחר תיקון הדגימה עם 1% אוסמיום טטרוקסיד, ו-1.5% אשלגן פרוציאניד במאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולרי למשך 120 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

שוטפים את הדגימה פעמיים במים מזוקקים כפולים בטמפרטורת החדר. התייבש על ידי טבילה בסדרה מדורגת של אתנול בטמפרטורת החדר. הסתנן לדגימה עם תחמוצת פרופילן ותערובות מדורגות שרף אפוסידי בטמפרטורת החדר באמצעות יחסי הנפח שהוזכרו.

למחרת, הטמיעו דגימות בשרף אפוסידי טרי 100% בתבניות, ופלמרו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

הרכיב את הבלוק של דגימה על מחזיק האולטרה-מיקרוטום. חתוך את הבלוק על פני השטח בעזרת סכין גילוח כדי להגיע לרמת הרקמה. התקן סכין יהלום מול הדגימה, ויישר את משטח הדגימה במקביל לסכין.

מייצרים חתך דק למחצה בעובי של 1 מיקרומטר בעזרת סכין היהלום כדי לבדוק את כיוון הדגימה. מכתים את החלק הדק למחצה בכחול טולואידין לתצפית במיקרוסקופ אור. לאחר מכן, חתוך את הבלוק עוד יותר כדי לצמצם את שטח העניין כדי לקבל חלקים דקים במיוחד מתאימים.

חותכים חלקים דקים במיוחד בעובי של 60 עד 70 ננומטר בעזרת סכין יהלום שנייה. אסוף 1 עד 2 חלקים על רשתות נחושת עם חור אחד באמצעות לולאה מושלמת. לניגוד החלקים, טבלו את הרשתות בתמיסת אורניל אצטט למשך 20 דקות, ושטפו את הרשתות במים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן, טבלו את הרשתות בציטראט עופרת למשך 15 דקות, ושטפו מחדש את הרשתות במים מזוקקים כפולים.

הפעל את מיקרוסקופ אלקטרוני השידור, המחשב ותוכנת הקלטת התמונה. הקלט תמונות דיגיטליות עם מצלמת CCD דיגיטלית לסריקה איטית, ותוכנת ההדמיה הנלווית. לאחר הכנסת הרשת עם מספר חלקים בשלב המיקרוסקופ, סנן את הרשת תחילה בהגדלה נמוכה כדי לבחור את החלקים האיכותיים ביותר, ולקבוע את כיוון סיבי השריר.

לאחר מכן, מקד את התמונה בהגדלה מעל 30,000, כאשר הקרן מרוכזת בסיב היקפי בקטע, והקלט תמונות עם זמן חשיפה של שנייה אחת בהגדלה הרצויה. ודא שהתמונות מופצות לאורך ורוחב הסיב בסדר אקראי, אך שיטתי כדי להשיג תוצאות בלתי מוטות, וחזור על ההדמיה עד להדמיית 6 עד 10 סיבים.

ייבא תמונות ל-imageJ על ידי לחיצה על קובץ, ולאחר מכן על פתח. הגדר קנה מידה גלובלי כך שיתאים לגודל המקורי של התמונה על ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן הגדר קנה מידה. כדי להגדיל 100%, לחץ על תמונה, עבור אל זום ולחץ על אין.

מדוד את העובי של דיסק Z אחד לכל תמונה של החלל המיופיברילרי, באמצעות הכלי קו ישר מתפריט כלים, וחשב את העובי הממוצע של דיסק Z של כל אחד מ-6 עד 10 הסיבים. השתמש בכלי קו מקוטע כדי למדוד את אורך המיופיבריל החיצוני ביותר, הנראה ממש מתחת לאזור התת-סרקולמלי.

כדי להוסיף רשת, לחץ על נתח, בחר כלים ולאחר מכן בחר רשת. כעת הגדר את השטח לנקודה על 32,400 ננומטר רבוע. ספרו את מספר הפגיעות באורך הזמין, ב-12 התמונות התת-סרקולמליות שבהן צלב פוגע בגליקוגן התת-סרקולמלי.

הוסף רשת על ידי לחיצה על ניתוח, לאחר מכן, בחר כלים, ואחריו רשת, והגדר שטח לנקודה על 160,000 ננומטר רבוע. ספרו את מספר הפגיעות ב-12 התמונות המיופיברילריות, שבהן צלב פוגע בחלל הפנימי

לאחר מכן, כדי להוסיף רשת, לחץ על נתח, בחר כלים ולאחר מכן בחר רשת. כעת, הגדר את השטח לנקודה על 3,600 ננומטר רבוע. ספרו את מספר הפגיעות ב-12 התמונות המיופיברילריות שבהן צלב פוגע בגליקוגן האינטרמיופיברילרי.

הוסף רשת על ידי לחיצה על ניתוח, לאחר מכן, בחר כלים, ואחריו רשת, והגדר שטח לנקודה על 32,400 ננומטר רבוע. ספור את מספר הפגיעות ב-12 התמונות המיופיברילריות שבהן צלב פוגע בגליקוגן הבין-מיופיברילרי.

השתמש ברשת של 32,400 ננומטר רבוע כדי לבחור באופן אקראי את חלקיקי הגליקוגן, התחל בריבוע השמאלי העליון וזז שמאלה במידת הצורך. באמצעות כלי קו ישר, מדוד את הקוטר של 5 חלקיקי גליקוגן שנבחרו באקראי של כל מאגר עבור כל אחת מ-12 התמונות כדי לקבל ממוצע של 60 חלקיקים למאגר לכל סיב.