מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

כדי לדמיין חלבונים ספציפיים של תגובת נזק ל-DNA בשבירת גדיל כפול של DNA, DSB, אתרים המשתמשים במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, מתחילים בשקופיות מיקרוסקופ המכילות חד-שכבות של תאים חד-גרעיניים אנושיים עם DSBs. תקן את התאים עם פרפורמלדהיד.

טפל בחומר ניקוי לא יוני, מחלחל ממברנות לגישה למטרות תוך-תאיות. הוסף תמיסת חסימה המכילה חלבון, החוסמת את אתרי הקישור הלא ספציפיים של התאים. דגירה עם נוגדנים ראשוניים הנקשרים לחלבוני תגובת המטרה.

טפל בתערובת נוגדנים משנית המתויגת בפלואורופורים שונים כדי להיקשר במיוחד לנוגדנים הראשוניים שלהם המחוברים לחלבונים. מכתים DNA עם DAPI. הוסף מדיום הרכבה; הרכיב את הכיסוי.

במהלך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אלומת האור המתרחשת מגיעה למסנן העירור ומאפשרת לאור באורך גל עירור ספציפי לעבור דרכו. בהגיעו למראה הדיכרואית - מפצל אלומה - אור העירור משתקף באופן סלקטיבי לעבר עדשת האובייקטיב, הממקדת את האור על הדגימה.

אור העירור המתרחש מעורר את האלקטרונים של הפלואורופור למצב אנרגיה גבוה יותר. בחזרה למצב הקרקע, האלקטרונים פולטים אור באורך גל ארוך יותר, שנאסף על ידי עדשת האובייקט, ומועבר בחזרה למראה הדיכרואית.

המראה מאפשרת לאור הקרינה הנפלט לעבור דרך מסנן הפליטה, המאפשר רק לאור הקרינה הרצוי להגיע לגלאי. עבד את התמונות. נתח את המוקדים הפלואורסצנטיים הצבעוניים השונים כדי לדמיין את הלוקליזציה המשותפת של חלבוני תגובת הנזק ל-DNA באתר DSB.

הכן שני ציטוספינים עם תאים חד-גרעיניים של דגימות המטופל על ידי צנטריפוגה של 1 x 10⁵ תאים לכל תכשיר. תקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של 4% PFA למשך 10 דקות.

לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר PBS למשך חמש דקות כל אחד על שייקר. לאחר מכן, יש לחדור לתאים עם 200 מיקרוליטר של 0.1% אוקטוקסינול-9 למשך 10 דקות. שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של תמיסת חסימה של 5% למשך חמש דקות כל אחד על שייקר מעבדה. חסום את התאים ב -30 מיליליטר של תמיסת חסימה טרייה של 5% למשך שעה.

הקיבוע והחדירה של התאים עם 4% פרפורמלדהיד ו-0.1% אוקטוקסינול-9 שימרו את מוקדי הגמא H2AX ו-53BP1 באופן מובהק.

דגרו תכשיר אחד של התאים עם נוגדן חד-שבטי נגד גמא H2AX של עכבר ואת ההכנה השנייה של התאים עם נוגדן חד-שבטי נגד גמא H2AX של עכבר ונוגדנים נגד 53BP1 של ארנב רב-שבטי למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.

מומלץ מאוד להשתמש בנוגדנים מוכחים נגד גמא H2AX ואנטי 53BP1.

לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של תמיסת חסימה של 2% לכל חמש דקות על שייקר מעבדה.

לאחר מכן, דגרו את ההכנה הראשונה של התאים עם נוגדן משני נגד עכברים מצומד Alexa488 מדולל 1 ל-500 בתמיסת חסימה של 2%. דגרו את התכשיר השני של התאים עם נוגדן משני נגד עכברים מצומד Alexa488 ונוגדנים משניים נגד ארנב מצומדים של חמור Alexa555 מדולל 1 ל-500 בתמיסת חסימה של 2%.

שטפו את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מיליליטר PBS על שייקר מעבדה. הסר את ה- PBS והרכיב את התאים עם מדיום הרכבה. בזהירות, הניחו כיסוי על גבי מדיום ההרכבה, כך שלא יוטבעו בועות אוויר. המתן לפחות שלוש שעות עד שמדיום ההרכבה יתקשה לפני ניתוח התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לבסוף, נתח את מוקדי הגמא H2AX ו-53BP1 בגרעיני התא עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור DAPI, Alexa488 ו-Cy3 במהלך הדמיה בהגדלה אובייקטיבית של פי 100.