ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית לזיהוי זרחונים מרובים בחלבונים

זרחונים מרובים בחלבון כרוכים בהוספת קבוצות פוספט לחלבון במיקומים שונים, במיוחד בשאריות סרין ותראונין.

כדי לזהות זרחונים מרובים בחלבון, התחל עם צינור המכיל חלבונים זרחניים המסומנים בחנקן-15, המסייע להבדיל בין מימן אמיד למימנים אחרים בחלבון.

הוסף תרכובת ייחוס פנימית של NMR למדידה מדויקת של תדרי התהודה היחסיים. העבירו את התערובת לצינור תהודה מגנטית גרעינית, או NMR. הכנס את הצינור לצמצם מסתובב, והנח אותו בספקטרומטר NMR.

נוכחותם של פוספטים מציגה השפעות משיכת אלקטרונים בשאריות הסרין והתראונין הזרחניות. כתוצאה מכך, נראה כי מימני האמיד של שאריות זרחניות מוגנים בצפיפות אלקטרונים נמוכה יותר בהשוואה למימן האמיד האחר.

מימן אמיד עם סביבות אלקטרוניות משתנות חווים שדות מגנטיים דיפרנציאליים סביב גרעינים, ומגיעים למצבים של אנרגיה נמוכה.

הפעל פולס קצר בתדר רדיו כדי לעורר את גרעיני המימן למצב אנרגיה גבוה יותר בתדר תהודה ספציפי המבוסס על הסביבה האלקטרונית שלהם.

במהלך הרפיה, הגרעינים חוזרים למצב של אנרגיה נמוכה על ידי שחרור האנרגיה הנספגת שמתגלה כדי לייצר אות NMR.

שרטט ספקטרום NMR דו-ממדי המייצג את מימן האמיד הבודד.

השווה את הספקטרום של החלבון הזרחני לזה של החלבון הלא זרחני. הופעת תהודה נוספת בספקטרום ה-NMR של החלבון הזרחני מאשרת זרחונים מרובים.

ממיסים 4 מיליגרם של ¹⁵N ו-13 C מועשר ב-15 N ^ו-13C מועשר ב-400 מיקרוליטר של מאגר NMR. הוסף 5% תחמוצת דאוטריום לחסימת שדה של ספקטרומטר NMR ו-TMSP של 1 מילי-מולרית כהתייחסות לאות NMR פנימי. כמו כן, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פי 40 של קוקטייל מעכב פרוטאז שלם.

העבירו את הדגימה בצינור NMR של 5 מיליליטר באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או באמצעות פיפטה פסטר. סגור את צינור ה-NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות האוויר הכלואות בין הבוכנה לנוזל על ידי הזזת הבוכנה.

הנח את צינור ה-NMR בספינר. השתמש במד המתאים כדי להתאים את מיקומו האנכי בספינר, כך שרוב תמיסת הדגימה תהיה בתוך סליל ה-NMR. לאחר מכן, התחל את זרימת האוויר במכשיר ה-NMR על ידי לחיצה על "הרם" בחלון מערכת בקרת המגנט. הנח בזהירות את הספינר עם הצינור בזרימת האוויר בחלק העליון של קדח המגנט, ולאחר מכן, עצור את זרימת האוויר ותן לצינור לרדת למקומו בתוך ראש הבדיקה בתוך המגנט.

לאחר שאפשרת לדגימה להתאזן ל-25 מעלות צלזיוס, הקלד 'atmm' בשורת הפקודה כדי לבצע כוונון והתאמה חצי אוטומטיים של ראש הבדיקה כדי לייעל את העברת הכוח. לאחר מכן, לחץ על "נעילה" בחלון מערכת בקרת המגנט כדי להפעיל את נעילת תדר השדה של הספקטרומטר.

התחל את הליך השימינג כדי לייעל את ההומוגניות של השדה המגנטי במיקום הדגימה על ידי הקלדת 'topshim gui' בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון ה-shim. לאחר מכן, לחץ על "התחל" בחלון ה-shim. בדוק את שאריות B אפס סטיית התקן כדי לוודא שה-shims אופטימליים.

לאחר מכן, כייל את הפרמטר P1, שהוא אורך דופק תדר רדיו של פרוטון במיקרו-שניות. פרמטר זה הכרחי כדי להשיג סיבוב של 90 מעלות של מגנטיזציה של ספין פרוטון. כוונו לפולס של 360 מעלות באמצעות ספקטרום חד מימדי של פרוטוני מים.

התאם את היסט התדר על ידי הגדרת הפרמטר 01 לתדר מי הפרוטונים בספקטרום החד-ממדי. לבסוף, התחל ברכישת ספקטרום פרוטונים חד מימדי על ידי הקלדת 'zg' בשורת הפקודה.