בדיקה חיסונית ישירה מבוססת ספקטרוסקופיית ראמאן לזיהוי אנטיגן ספציפי

התחל בדגירה של מולקולות צבע מדווח ראמאן עם ננו-חלקיקי זהב כדי שהכתבים ייקשרו לננו-חלקיקים.

הוסף פוליאתילן גליקול, נוגדנים מצומדים ל-PEG ספציפיים לאנטיגן המטרה. הנוגדנים נצמדים באופן קוולנטי לננו-חלקיקים באמצעות קשירת זהב-דיסולפיד. הוסף PEGs מצומדים לתיול כדי לחסום את אתרי הננו-חלקיקים הנותרים ולמנוע צבירת ננו-חלקיקים, וליצור בדיקות ננו-חלקיקים.

מצפים בארות צלחת בדיקה חיסונית עם אנטיגן המטרה. חסום את אתרי הצלחות הנותרים בתמיסה המכילה חלבונים. הוסף את בדיקות הננו-חלקיקים. בצע דילול בדיקה סדרתי על פני הבארות. דגירה כדי שהנוגדנים בבדיקות ייקשרו לאנטיגנים ויוצרים קומפלקסים.

השתמש במיקרוסקופ ראמאן כדי לקבוע את התגובה האופטית של הגשושית. הלייזר המונוכרומטי הפוגע מעורר את אלקטרוני פני השטח של ננו-חלקיקי הזהב וגורם לתנודתם, ויוצר שדה אלקטרומגנטי מקומי גבוה על פני השטח.

קרן האירוע וכתבי ראמאן מתקשרים, וגורמים לאור לא אלסטי משופר או לפיזור רמאן באורכי גל ותדרים שונים עקב השדה האלקטרומגנטי המוגבר. אות הרמאן הנפלט באופן לא אלסטי משמש ליצירת ספקטרום ראמאן.

שרטט את האזור הספקטרלי של פסגת מדווח הרמאן כנגד ריכוז הגשושית כדי למצוא את הגבול התחתון של זיהוי הגשושית ולהקל על זיהוי רגיש יותר של האנטיגן.

על מנת להכין את בדיקות הראמאן, הכינו תחילה שתי קבוצות של 1.5 מיליליטר של ננו-חלקיקי זהב ואת מדווח הרמאן בריכוזים שנקבעו כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

זה נעשה על ידי שילוב של כתב רמאן ותמיסות ננו-חלקיקי הזהב ומאפשר להם להיקשר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הנוגדנים PEGylated לאחת מתמיסות ננו-חלקיקי הזהב הקשורים לדיווח כדי ליצור יחס של 200 ל-1 של נוגדנים לחלקיקים. פתרון זה יהיה עבור דגימות הבדיקה.

בצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד הוסף אנטיגן PEGylated לתמיסת ננו-חלקיקי הזהב האחרת הקשורה לדיווח ביחס של 200 ל-1 של אנטיגן לחלקיקים שישמשו כבקרה. דגרו על שני התמיסות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, חסום את האתרים הנותרים על פני השטח של הננו-חלקיקים. כדי להשיג זאת, ראשית, ממיסים מתוקסי פוליאתילן גליקול תיול מוצק לריכוז של 200 מיקרומולר באמצעות מי HPLC. מערבל את התמיסה עד להמסה מלאה של התיול. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת התיול ביחס של 40,000 ל-1 לתמיסות נוגדני ה-PEG הקשורות לננו-חלקיקים, ודגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להבטיח שהאתרים הנותרים על ננו-חלקיק הזהב חסומים.

לאחר מכן, שחזר את בדיקות ה-Raman המתפקדות על ידי צנטריפוגה של החלקיקים בצינורות צנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה כך שהסופרנטנט יהיה צלול. הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטינג אך היזהר לא להפריע לננו-חלקיקים. לאחר מכן, השעו מחדש את הננו-חלקיקים עם 1 מיליליטר של PBS.

העריכו את ריכוז ננו-חלקיקי הזהב על ידי לקיחת מדידת UV גלויה מכשלושה מיקרוליטרים של התמיסה והשוו את התוצאות לאלו מריכוז ננו-חלקיקי זהב ידוע מכיוון שזהו קשר ליניארי.

אם הננו-חלקיקים אינם חסומים מספיק, הם יצטברו עקב כוחות הידבקות בין חלקיקים המרמזים על כך שהריאגנטים נוספו בריכוזים שגויים. בדרך כלל, הפתרון הוא צבע אדום עמוק אך הצבירה יוצרת גוון אפור.

התאם את עוצמת הקול כך שהתמיסות הסופיות יהיו לפחות 1 x 10¹¹ חלקיקים למיליליטר ואחסן את התמיסות ב-4 מעלות צלזיוס עד שישמשו לתפקוד לוחית הבדיקה החיסונית. השתמש בפתרונות אלה תוך שבוע אחד. ראשית, הכינו מספיק מהאנטיגן המדולל כדי למלא את בארות הפוליסטירן. לאחר מכן, מערבל את התמיסה והוסף מיד את התמיסה לבארות הצלחות.

הניחו לאנטיגן להיקשר לצלחות למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את תמיסת האנטיגן העודפת על ידי השלכת התמיסה, ופגיעה בצלחת על שולחן מכוסה במגבת נייר. הוסף TBST לבארות כדי לשטוף את פני השטח. לאחר מכן, הסר את הכביסה על ידי השלכת התמיסה שוב ופגיעה בצלחת על שולחן מכוסה במגבת נייר.

לאחר מכן, חסום את אתרי הקישור הנותרים בצלחת כדי למנוע קשירה לא ספציפית על ידי הוספת 70 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת HSA לכל באר של הצלחת, ודגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה ושטוף את הצלחת שלוש פעמים עם TBST, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר הסרת השטיפה האחרונה, מכסים את הצלחת ושומרים אותה יבשה בחום של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

הוסף 140 מיקרוליטר של ננו-חלקיקי הגשושית שהוכנו בעבר לעמודה הראשונה של צלחת של 96 בארות, והניח את ננו-חלקיקי הבדיקה בחמש השורות הראשונות ואת ננו-חלקיקי הבקרה בשלוש השורות האחרונות. הוסף 70 מיקרוליטר PBS לכל העמודות האחרות.

מדללים כל עמודה באמצעות דילול טורי של 1 עד 2. התחל בלקיחת 70 מיקרוליטר מהעמודה הראשונה, וערבוב עם השנייה. לאחר מכן, קח 70 מיקרוליטר מהעמודה השנייה והוסף אותה לשלישית, וכן הלאה. הניחו לצלחת לדגור לפחות שעה.

לאחר מכן, הסר את בדיקות הננו-חלקיקים הלא קשורות ושטוף את הצלחת עם TBST חמש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר הכביסה הסופית, הוסיפו 70 מיקרוליטר PBS לכל באר וכסו את הצלחת בחותם צלחת. בדוק שדגימות הבקרה ברורות. אם התרחשה קשירה לא ספציפית, דגימות הבקרה יהיו בעלות צבע דומה לדגימות הבדיקה.

באמצעות מיקרוסקופ ראמאן הפוך, מקד את המטרה על פני הבאר שיש בה בדיקות ננו-חלקיקי זהב. השג ספקטרום ראמאן של הבאר. אסוף ספקטרום שנע בין 1800 סנטימטרים הפוכים ל -400 סנטימטרים הפוכים וחזור על כך עבור כל באר. לבסוף, בצע את השלבים בחלק האחרון של פרוטוקול הטקסט הנלווה כדי לקבוע את רגישות ההגדרה.