האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור רשת כלי דם אנושית in vivo. הדבר מושג תחילה על ידי תרבית של תאים יוצרי מושבות אנדותל>) מ nguồn דם אנושי ותאים גזעיים מזנכימליים מ nguồn מח עצם אנושי. שני סוגי התאים מעורבבים לאחר מכן לג'ל מבוסס קולגן, המוזרק תת-עורית לעכבר עם חסר חיסוני.

שבעה ימים לאחר מכן, השתל מוסר ונבדק לצורך הערכת היווצרות רשת כלי דם אנושית. בסופו של דבר, ניתן לאמת את נוכחותם של מיקרו-כלי דם ספציפיים לאדם בתוך השתלים באמצעות היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני שיטה מסורתית, כגון השתלה כירורגית של מבנה, הוא שהיא פשוטה, קלה לביצוע ואינה דורשת ניתוח.

התחילו בהפשרת מבחנה אחת של E CFCs ודללו מיד את התאים במבחנה קונית של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של DMEM. סבבו את תרחיף התאים ב-1200 RPM למשך חמש דקות וסספנדו מחדש את משקע התאים ב-10 מיליליטר של מצע EGM two חם. לאחר מכן, העבירו את התאים לצלחת תרבית רקמות של 100 מילימטר מצופה ב-1% ג'לטין והדגירו את התאים למשך הלילה באינקובטור לח.

בבוקר למחרת, שאבו בעדינות את המצע ואת כל התאים שאינם קשורים. לאחר מכן, העבירו לתאי הקשר 10 milliliters של מצע E GM two טרי. המשיכו בתהליך זה במהלך הימים הבאים עד להיווצרות שכבה Ein-monolayer רצופה.

לאחר מכן, שטפו את התאים עם 10 milliliters של PBS. החליפו את ה-PBS בשני milliliters של tripsin EDTA והחזירו את הצלחת לאינקובטור למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, תחת מיקרוסקופ, הקישו בעדינות על הצלחת ובדקו אם התאים התנתקו.

אם לא, חזרו על הדגריות הקצרות תוך כדי ניעור עדין. לאחר שהתאים התנתקו לחלוטין, הוסיפו שמונה מיליליטרים של מדיום EGM two לתאים והעבירו את התאים לפרוקת קונית של 15 מיליליטר. ספרו את התאים וסובבו אותם ב-1200 RPM למשך חמש דקות.

כעת זרעו את התאים על פלטות לתרבית רקמה המצופות ב-1% gelatin בצפיפות זריעה של 5,000 תאים לסנטימטר רבוע. הדגרירו את התאים ב-EGM two medium והזינו אותם כל יומיים עד שלושה ימים ב-EGM two medium. חזרו על נוהל זה במעברים הבאים, בין מעבר ארבעה לשמונה.

תאי ה-E CFCs יהיו מוכנים לשימוש. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם להגדלת MSCs. פשוט החליפו את מצע ה-E GM two במצע M-S-C-G-M.

השתמשו בצלחת תרבית לא מצופה. התחילו בתרבית משנית כאשר הגעתם ל-80% confluence, ובצעו תרבית משנית בצפיפות זריעה של 10,000 תאים לסמ"ר. ניסוי זה דורש 800,000 E CFCs ו-1,200,000 MSCs לכל השתלה.

בדרך כלל מכינים חמישה שתלים בו-זמנית. ראשית, שאיפו את מצע התרבית מלוחיות התרבית, ושטפו כל לוחית תאים עם 10 milliliters של PBS. החליפו את ה-PBS בשני milliliters של trypsin EDTA והדגירו את הלוחות תוך써 ניעור עדין.

בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ מדי שתיים עד חמש דקות, עד שכל התאים יתנתקו. לאחר מכן, הוסיפו 8 milliliters של DMEM ואספו את תמיסת התאים. בתוך מבחנה קונית של 15 milliliters, ספרו את התאים והעבירו כמות תאים המספיקה לחמישה השתלה למבחנה קונית אחת של 15 milliliters.

לאחר מכן, סובבו את התאים ב-1200 RPM למשך חמש דקות והסירו את העלייה. הכינו בזהירות תערובת של fibrinogen ו-collagen fibronectin על קרח. לאחר מכן, השביו בעדינות רבה את משקע התאים בתערובת הקרה שמוכנה על קרח.

העמיסו את תרחיף התאים למזרק של own one milliliter תוך הימנעות מהיווצרות בועות אוויר, וחברו מחט gauge 26 עם מכסה. השאירו את המזרק הטעון על קרח עד להזרקת תערובת התאים. הרדימו ארבעה עכברים athymic nude immunodeficient בני שישה שבועות באמצעות תא ISO fluorine.

לאחר שהעכברים הושקעו בהרדמה ואינם מגיבים לצביטה בבהו, המשיכו להזרקות עבור כל עכבר. השתמשו במחט במידה 30 כדי להזריק 50 µL של תמיסות thrombin תת-עורית לאזור הגבי העליון. באותו מיקום, הזריקו 200 µL מתערובת התאים.

בעזרת מחט במידה 26, המקרו-מולקולות המוזרקות יגבשו ויהוו בליטה קטנה אך ניכרת מתחת לעור. לאחר ההזרקה, הניחו את העכברים על שכבת גזה למען נוחותם וחימום. עקבו אחריהם עד שיחזרו לניידותם.

במהלך שלושת הימים הבאים, בצעו תצפית יומית על מצב הבריאות הכללי של החיה. שבוע לאחר ההזרקות, בצעו דה-אוטנזיה לעכברים באמצעות פחמן דו-חמצני והוציאו את פלג הג'ל בניתוח. לאחר השליפה, צלמו את פלגי הג'ל לצד סרגל, ולאחר מכן הניחו כל פלג ג'ל בתוך קסטה היסטולוגית והטביעו אותם ב-10% neutral buffered formalin למשך לילה בטמפרטורת החדר.

ביום למחרת, שטפו את הפורמלין בבופר ניטרלי בריכוז 10% באמצעות מים מזוקקים. אחסנו את הקסטות ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לביצוע ההערכה ההיסטולוגית. הכינו חתכים בעובי של שבעה מיקרון של השתל הטבול בפרפין.

לאחר מכן, כמת את צפיפות מיקרו-כלי הדם בחלק המרכזי של השתלים. בעזרת צביעת H and e, חשב את מספר כלי הדם למילימטר רבוע כדי להוכיח את מקורם האנושי של כלי הדם המיקרו-וסקולריים. צבע את החתכים עם נוגדן anti-human CD 31 זמין מסחרית בדילול של 1:100.

תמונת ניגודיות פאזה זו מראה את מורפולוגיית "מרוצפי הדרכים" (cobblestone) האופיינית לתאי אנדותל בשכבה בודדה (monolayer) טיפוסית ומתאיחה של eCFCs המופקים מדם חבל טבילה. תמונה זו מראה את מורפולוגיית צורת הפסולה הטיפוסית של MSCs המופקים ממח עצם אנושי. לאחר דגירה של שבוע במארח העכבר, השבתי, המסומן בקו מקווקו צהוב, נראה שונה מאוד מרקמות המארח בהגדלה גבוהה יותר.

מספר מיקרו-כלי דם נחשפו, כאשר המבנים הלומינליים שלהם מכילים תאי דם אדומים ומסומנים בחצי חצים צהובים. כאשר הפלאגים נבחנו באופן אימונוהיסטוכימי, הלומן של המיקרו-כלי הדם הגיב לנוגדן מונוקלונלי ל-CD 31 אנושי. גרעיני התאים נצבעו בצבע נגדי עם המטין.

ברגע שהטכנולוגיה נשלטת, ניתן לבצע אותה בתוך אונקייה אחת אם היא מבוצעת כראוי.