החדרת חלבוני השפעה חיידקיים לתאי יונקים על ידי אלקטרופורציה

פתוגנים חיידקיים גראם-שליליים מסוימים יוצרים קשר עם תאי המארח ומשתמשים במערכות הפרשה כדי להזריק חלבוני אפקטור, מה שמקל על פלישת התאים.

כדי להעביר חלבוני אפקטור לתאי יונקים במבחנה, פיפטה תאי יונקים לקובטה מקוררת. הוסף חלבוני אפקטור חיידקים המתויגים בפפטיד קושר סטרפטווידין וערבב.

בצע אלקטרופורציה. במהלך הריצה, פולסים חשמליים קצרים משבשים את שכבת השומנים של קרום התא המארח ליצירת נקבוביות חולפות, מה שמקל על הכניסה התאית של חלבוני אפקטור. צלחו את התאים על צלחת זכוכית המכילה מדיה, המאפשרת לתאים להתאושש ולהיצמד לצלחת. הנקבוביות נאטמות מחדש, ולוכדות את החלבונים שבתוכן.

לאחר התאוששות התאים, תקן וחלחלחל את התאים לגישת נוגדנים למטרות תוך-תאיות. דגירה עם תמיסת חסימה המכילה חלבון למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים. הוסף נוגדנים ראשוניים הנקשרים באופן ספציפי לתג הפפטיד הקושר סטרפטווידין על חלבוני האפקטור התוך-תאיים.

להציג נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים ראשוניים הקשורים לחלבוני אפקטור לצורך הדמיה. הוסף נבט חיטה מצומד פלואורופור אגלוטינין ו-DAPI כדי להכתים גליקופרוטאינים ו-DNA של קרום התא, בהתאמה.

באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, דמיין אותות פלואורסצנטיים מחלבוני אפקטור, קרומי תאים ו-DNA.

תאים שעברו אלקטרופוציה מוצלחת מציגים אותות פלואורסצנטיים תוך-תאיים משמעותיים מחלבוני אפקטור, מה ש