החדרת חלבוני השפעה חיידקיים לתאי יונקים על ידי אלקטרופורציה

פתוגנים חיידקיים גראם-שליליים מסוימים יוצרים קשר עם תאי המארח ומשתמשים במערכות הפרשה כדי להזריק חלבוני אפקטור, מה שמקל על פלישת התאים.

כדי להעביר חלבוני אפקטור לתאי יונקים במבחנה, פיפטה תאי יונקים לקובטה מקוררת. הוסף חלבוני אפקטור חיידקים המתויגים בפפטיד קושר סטרפטווידין וערבב.

בצע אלקטרופורציה. במהלך הריצה, פולסים חשמליים קצרים משבשים את שכבת השומנים של קרום התא המארח ליצירת נקבוביות חולפות, מה שמקל על הכניסה התאית של חלבוני אפקטור. צלחו את התאים על צלחת זכוכית המכילה מדיה, המאפשרת לתאים להתאושש ולהיצמד לצלחת. הנקבוביות נאטמות מחדש, ולוכדות את החלבונים שבתוכן.

לאחר התאוששות התאים, תקן וחלחלחל את התאים לגישת נוגדנים למטרות תוך-תאיות. דגירה עם תמיסת חסימה המכילה חלבון למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים. הוסף נוגדנים ראשוניים הנקשרים באופן ספציפי לתג הפפטיד הקושר סטרפטווידין על חלבוני האפקטור התוך-תאיים.

להציג נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים ראשוניים הקשורים לחלבוני אפקטור לצורך הדמיה. הוסף נבט חיטה מצומד פלואורופור אגלוטינין ו-DAPI כדי להכתים גליקופרוטאינים ו-DNA של קרום התא, בהתאמה.

באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, דמיין אותות פלואורסצנטיים מחלבוני אפקטור, קרומי תאים ו-DNA.

תאים שעברו אלקטרופוציה מוצלחת מציגים אותות פלואורסצנטיים תוך-תאיים משמעותיים מחלבוני אפקטור, מה שמרמז על לוקליזציה תוך-תאית שלהם.

כדי להתחיל בהליך זה, העבירו 400 מיקרוליטר של תרחיף תאים לקובטה מקוררת מראש, ולאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוגרם של חלבון נבחר כדי להגיע לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר. העבירו את הקובט בעדינות, כ-10 פעמים לערבוב וכדי למנוע נזק לתאים. לאחר מכן, יבש את החלק החיצוני של הקובט במגבת נייר כדי למנוע קשת חשמלית באלקטרופורטור.

הנח את הדגימה באלקטרופורטור והגדר אותה ל-0.3 קילו-וולט למשך 1.5 עד 1.7 אלפיות השנייה. מיד לאחר אלקטרופורציה, החלק את הקובט בעדינות, כ-10 פעמים, כדי לערבב את הדגימה היטב לפני שתמשיך לקיבוע וצביעה אימונופלואורסצנטית או טיהור זיקה.

לאחר ארבע שעות של התאוששות מאלקטרופורציה, יש לשטוף את התאים ב- PBS סטרילי. לאחר מכן, מקבעים את התאים ב-100% מתנול למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS סטרילי שלוש פעמים נוספות. לחדור לתאים עם 0.4% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות. התאם את אורך החדירות ואת החוזק של Triton X-100 בהתאם לאפיטופ ולמיקום של חלבון המטרה. לאחר מכן, חסמו את התאים עם 5% BSA ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, דגרו אותם עם הנוגדן העיקרי בתמיסת קשירת הנוגדנים למשך הלילה, ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין.

למחרת, שטפו את התאים ארבע פעמים נוספות עם PBS. לאחר מכן, דגרו אותם עם הנוגדן המשני המצומד פלואורסצנטי המתאים בתמיסת קשירת הנוגדנים. הוסף כתמים אחרים לפי הצורך, כגון 5 מיקרו-מולרי נבט חיטה אגלוטינין, או WGA, מצומד ל-Alexa 647 או DAPI למשך שעה בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור. לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS חמש פעמים ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור עד שהם מוכנים לצילום.