מיקרוסקופ תוך חיוני לניתוח אינטראקציות תאי דם-אנדותל במודל עכבר דלקתי

התחל עם עכבר מורדם שהוזרק תוך צפקי עם ליפופוליסכריד כדי לגרום לדלקת.

חתכו את הבטן כדי לחשוף את חלל הבטן. שמרו על לחות האיברים עם מי מלח. הזרקת רודמין 6G רטרו-אורביטלית. מולקולות הצבע הפלואורסצנטיות נכנסות למחזור הדם ומסמנות לויקוציטים וטסיות דם לצורך הדמיהן.

כעת, הוציא לולאה של אילאום עם כלי המזנטריה שלו. שמרו על לחות הרקמה עם מי מלח מחוממים מראש להדמיה מיטבית. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התמקדו בווריד מזנטרי למיקרוסקופיה תוך-חיונית.

הזרקת הליפופוליסכריד גורמת להפעלת תאי אנדותל עם ויסות מוגבר של מולקולות הדבקה, כולל סלקטינים. טסיות דם במחזור מגויסות לאנדותל, שם הן נקשרות באמצעות אינטראקציות ספציפיות של מולקולת הדבקה-ליגנד, ויוצרות מתחמי הידבקות.

בשל אינטראקציות אלה, טסיות הדם מופעלות ומשחררות גרגירים המכילים מולקולות, כולל סרוטונין, המקדמים גיוס לויקוציטים.

לויקוציטים עוברים אל פני האנדותל ונקשרים לטסיות דם מופעלות. יתר על כן, לויקוציטים מתגלגלים לאורך האנדותל ונקשרים לתאי האנדותל באמצעות אינטראקציות דבק חלשות. תנועה מתגלגלת מפעילה אינטגרינים של לויקוציטים להדבקה איתנה לתאי אנדותל, חיוניים לגלגול לויקוציטים-אנדותל.

באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית, דמיין את הלויקוציטים והטסיות הפלואורסצנטיים כדי לקבוע את האינטראקציות שלהם בזמן אמת עם תאי אנדותל.

ארבע שעות לפני ההדמיה התוך-חיונית, הזריק 20 מיליגרם לק"ג LPS IP לעכבר זכר בן 16 עד 20 גרם 4 עד 6 שבועות כדי לגרום לתגובה דלקתית חיידקית מדומה.

יש לחמם מראש תמיסת מלח של 0.9% באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להרטיב את תא הפלסטיק ורקמת המזנטריה גם בשלב זה. לאחר מכן, אשר את עומק ההרדמה המתאים על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן בעכבר שטופל ב-LPS, ולאחר מכן מרח משחה על עיני החיה.

הסר את הבטן בעזרת מכונת גילוח, והסר כל שיער רופף עם גזה ספוגה באתנול 70%. לאחר מכן, השתמש במלקחיים קטנים ומעוקלים ובמספריים כדי לפתוח את הבטן.

זהה את כלי הדם האפיגסטריקליים, ופתח את הצפק באזור הלינאה אלבה כדי להגן על הכלים. מרחו כמה טיפות של מי מלח שחוממו מראש לתוך חלל הבטן כדי לשמור על לחות הרקמה, ולאחר מכן הזרקה רטרו-אורביטלית של 50 מיקרוליטר רודמין 6G כדי לסמן את תאי הדם במחזור הדם. לאחר מכן, הניחו את העכבר בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים, הוצאו לולאה של אילאום והניחו את מי המלח שחוממו מראש כל דקה שנייה כדי לשמור על לחות הרקמה.

כדי להמחיש את התגובה הדלקתית על ידי מיקרוסקופיה תוך-חיונית, הנח את העכבר מתחת למיקרוסקופ והביא לשדה הראייה וריד מזנטרי בקוטר של 200 עד 300 מיקרומטר וכמה שפחות שומן גלוי מסביב.

באמצעות תוכנת המיקרוסקופ המתאימה, רשום את האינטראקציות בין תאי הדם לאנדותל למשך דקה אחת ב-4 ורידים שונים לכל עכבר. לאחר מכן, כדי לנתח את התגובות מתא לתא, אשר את תנאי זרימת הדם היציבים והבין-אישיים.

כדי לכמת את מספר הלויקוציטים המתגלגלים, ציירו קו אנכי דרך הווריד, וספרו ידנית את כל הלויקוציטים שחוצים את הקו הזה בדקה אחת. כדי לקבוע את מהירות הגלגול, צייר שני קווים אנכיים דרך הווריד במרחק של 50 מיקרומטר זה מזה, ומדוד את הזמן שלוקח ללויקוציט בודד לחצות בין הקווים תוך כדי גלגול יציב על האנדותל.

כדי למדוד את הידבקות הלויקוציטים, צייר ריבוע בגודל 200 על 200 מיקרומטר בווריד. לאחר מכן ספרו ידנית את הלויקוציטים הנצמדים היטב שאינם מראים תנועה נראית לעין בתוך הריבוע למשך 30 שניות. לבסוף, כדי לכמת את האינטראקציות בין טסיות ללויקוציטים, ספרו ידנית את מספר הטסיות הקשורות ללויקוציטים אחד.