Name: הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למדו שיטת in ovo להצבת חרוזים מצופי פקטור צמיחה בעוברי תרנגולת בשלב E2.5. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת פקטורי הצמיחה על גורל התאים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הסר ביצים מן החממה ב-E2 2.5 (~ 17 סנט HH), להסיר את הביצים ולהכין אותם בהתאם. הם יכולים להיות עבד או מיד חזר החממה עבור כמה שעות. הביצים ניתן להציב בטמפרטורת החדר בבטחה במשך יותר משעה. ביצים יכולים להישאר בחוץ למשך מניפולציות. לפעמים אלה יכול לקחת שעה או יותר. הערה: ככל שהם בטמפרטורת החדר, סביר פחות הם לשרוד. 2. הכנת הודו דיו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חדש של דיו הודו 4% PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 3 מ&quot;ל עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 27, מחט מד ½ אינץ&#39; על המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות זוג hemostats, לכופף את המחט עד זווית של 90 מעלות. </li></ol> 3. פתיחת ביצים הזרקת דיו הודו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים, לקלף את הקלטת אחורה לפתוח את החלון, לקבע אותו באמצעות הצד ההפוך של הסרט בצד האחורי של הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך את המחט בזווית עד שהוא נמצא ממש מתחת העובר. הנחת את המחט מתחת לדיסק צף מבטיח את הדיו, שהוא רעיל לעובר, לא יבוא במגע ישיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה צריך רק להזריק דיו מספיק כדי ליצור ניגוד נוח. זה בדרך כלל פחות מ ¼ מ&quot;ל. </li></ol> 4. פתיחת בצינור העצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח זוג מספריים לנתיחה בסדר לחתוך את קרום דק שמונח על גבי, או לפעמים סביב, את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו זוג 55 מלקחיים או בדיקה טונגסטן, לפתוח את הצינור העצבי מן האחורי כדי הקדמי. ודא פתיחת הוא גדול מספיק כדי למקם חרוז לתוך זה. </li></ol> הערה: בהתאם לגיל, בדיקה טונגסטן קנס יכול לשמש כדי לעשות את אותו הדבר. 5. אחזור מצופי הפרין, אקריליק חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים 55, למצוא חרוז שלם בפתרון. תן חרוז לצרף את עצמו בקצה, לאט לאט לסגור את מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חרוז מפתרון ולהביא אותו על גבי הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חרוז הוא מתוך פתרון, הוא לא יבוא ככל הנראה מחוץ עד הושם על אלבומין. </li></ol> 6. הצבת חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חרוז הושם על החלק העליון של היעד באזור, השתמש בדיקה טונגסטן כדי להנחות אותו לעבר המוח הקדמי או לתקן את זה למוח האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של PBS בעזרת פיפטה μL 10. </li></ol> 7. סגירת ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הביצה בעזרת חתיכה דקה של הקלטת לסגור את החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הביצה על פי פרוטוקול prepping, זמין ב <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין הצהרות על ניגוד עניינים.

בהתאם החלבון אתה רוצה להשתמש, ישנם פרוטוקולים שונים על איך להכין את החרוזים. בניסויים אלה, אנו משתמשים הפרין, אקריליק חרוזים, אבל Affi ג&#39;ל חרוזים יכול לשמש גם. מצאנו כי הפרין, אקריליק חרוזים קל יותר לתמרן בסביבה מימית של הביצה אלבומין. חרוזים הם ספוגים אני 5 של חלבון לילה בשעה 4 ° C. חרוזים בקרה ממוקמים PBS סטרילי עד ימי השמה. היתרון בשימוש בהכנת אובו היא כי העובר עדיין חי וחופשי לפתח בדרך כלל 1. למרות הסביבה שבה explant נשמר ניתן לשלוט על משתנים מסוימים, העובר לגור מאפשר ייצוג מדויק של...

<table><tbody><tr><td>ביצים</td><td>בעל חיים</td><td></td><td></td><td>מופריות, E2-2.5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיו סינית</td><td>כלי</td><td>Higgins</td><td></td><td>יש להכין תמיסה בריכוז 4% ב-PBS סטרילי.</td></tr><tr><td>PBS סטרילי</td><td></td><td></td><td></td><td>לחלופין, ניתן להשתמש בתערובת נוגדנים</td></tr><tr><td>מזרק 1ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטים 27G 1/2</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>בזווית של 90 מעלות</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>גודל 55</td></tr><tr><td>תפסני המוסטט</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספרי ניתוח</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8.5cm</td></tr><tr><td>סרט Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td>לאטימה של הביצים</td></tr><tr><td>גשש טונגסטן</td><td>כלי</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>כלי מס' 24. ידית אופציונלית.</td></tr></tbody></table>

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

בצינור העצבי מבטא חלבונים רבים בדפוסי spatiotemporal ספציפיים במהלך ההתפתחות. חלבונים אלה הוכחו להיות קריטי לקביעת גורל התא, נדידת תאים, היווצרות של מעגלים עצביים. אינדוקציה דפוסים עצביים לערב המוךפו&quot;גנטי שהולך עצם חלבון (BMP), סוניק הקיפוד (ששש), גורם גדילה פיברובלסטים (FGF), בין היתר. בפרט, את דפוס הביטוי של Fgf8 הוא בסמיכות לאזורים להביע BMP4 ו ששש. דפוס זה עולה בקנה אחד עם הביטוי אינטראקציות התפתחותי המאפשרים דפוסים בתוך telencephalon. כאן אנו מספקים הדגמה חזותית של שיטה שבה כהכנה אובו ניתן להשתמש כדי לבדוק את ההשפעות של Fgfs במבנה של המוח הקדמי. חרוזים הם מצופים חלבון והושמו הצינור העצבי בפיתוח לספק חשיפה מתמשכת. כי ההליך משתמשת קטן, חרוזים להציב בזהירות, היא פולשנית ומאפשרת כמה חרוזים כדי להיות ממוקם בתוך צינור עצבי יחיד. יתר על כן, השיטה מאפשרת המשך הפיתוח, כך עוברים ניתן לנתח בשלב בוגר יותר לזהות שינויים באנטומיה של דפוסים עצביים. זה פרוטוקול פשוט אבל שימושי מאפשר הדמיה בזמן אמת. הוא מספק אמצעים לערוך שינויים מוגבל במרחב ובזמן לרמות חלבון אנדוגני.

קיים מגוון של גורמי גדילה וחלבונים אינטראקציה לגרום לתאים לקחת על גורלות תאים שונים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מדגימים את השימוש כהכנה אובו לכתובת האינטראקציות האפשריות בין חלבונים שונים בהתפתחות ידי הצבת חרוזים על E2.5 עוברי אפרוח.

הצינור העצבי מבטא חלבונים רבים בדפוסים מרחביים-זמניים ספציפיים במהלך ההתפתחות. חלבונים אלו הוכחו כקריטיים עבור תאים...

ברוכים הבאים למעבדת Raburn. אני Matt Korn מהמחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות באוניברסיטת קליפורניה ב-Irvine. היום נקח ביצה, נפתח אותה ונמקם בתוכה חרוז שהושרה בגורם גדילה.ההכנה המופלאה של ביצה תאפשר לנו להחדיר פקטור גדילה כדי לשנות את גורלם של מספר סוגים שונים של רקמות בשלב מוקדם זה של ההתפתחות העוברית. יום שני וחצי, או שלב 17. אוקיי, אנחנו נמצאים כאן ליד המיקרוסקופ.הביצים שלי וכל הכלים שלי מוכנים. אז קדימה, פשוט תמשכו ביצה כאן ותראו איפה נמצא הסרט שלנו. אטם החלון.יש לי כאן דונאט קטן ונחמד. הוא עשוי פשוט מחימר אמנותי שניתן להשיג בחנות לאמנות. ואני אקח זוג פינצטות גרוע מאוד.אלו קיימים כבר זמן רב. קצות החודים הם די קהים, אך הם עובדים מצוין כדי להרים את הסרט בדיוק מספיק כדי שהחלון ייפתח. אני יכול להוריד אותם.אני פשוט אקפל את זה ואדחף את הביצה, את החלון הזה מאחור בצורה כזו. עכשיו אני יכול להניח את זה תחת המיקרוסקופ ולבצע כל סוג של מניפולציה. במקרה הזה, נשתמש בחרוזים, ואני אגש כעת להביא את ה-India ink שלי, ללא ה-India ink.ניתן לראות שיש כאן מעט מדיסק עוברי, והוא נמצא מעט בצד. לכן, אם רק אסובב את הביצה, אוכל לראות היכן חלק מהדם יוצר מעגל כאן. כעת אוכל להשתמש במחט עם הדיו ההודי.כעת ארחיק מעט הצידה, ואגש אל מתחת לדיסקה שם נמצאו העובר. אינני רוצה להכניס אותו עמוק מדי, אלא רק מספיק כדי לראות את הניגודיות של העובר מול הרקע השחור. לאחר מכן, אני פשוט אסובב זאת כך שהחלק הרוסטרלי של העובר יפנה קדימה.וכאן ניתן לראות את אזור ה-cephalon. צינור העצבים חוזר לכאן וישנם מספר סומייטים המאפשרים לנו לקבוע את גילו. ואם אבצע זום, ניתן לראות שללב יש פעימה איטית מאוד אך עקבית, וזה מצוין.הלב היה שם, אך לא פעם. היינו צריכים להיות מעט מודאגים לגבי השאלה אם זהו דגימה חיונית או לא. כיוון שאין מעליה ממברנה עבה באמת, אני יכול פשוט לעבור לפרובת הטונגסטן שלי כאן.כאן יש ממברנה דקה, ואני פשוט אזיח אותה הצידה כדי שאוכל לגשת לעובר. אנו מניחים חרו지를 במוח הקדמי וכן במוח האחורי. ובמקרה הזה, אני אכוון למוח הקדמי.כעת, כדי להגיע לשם, עלי לחתוך דרך ממברנה. כאשר הם צעירים יותר, אני יכול פשוט להשתמש במ probes טונגסטן ולהיכנס דרך צינור העצבים, ואז תהיה לי גישה לאזור שבו אני רוצה להניח את החרוז. ועכשיו אני אעבור ל-probes הטונגסטן שלי.ואני משתמש בשתי ידיים רק כדי לייצב את ידי. אני אמשיך כעת להניע את העובר. ברגע שאכניס לכאן את החרוז, אוכל להניח אותו ישירות לתוך הצינור העצבי ועד למוח הקדמי.בסדר, כעת לאחר שפתחתי את העובר, אני יכול להמשיך להכין אותו ולהניח את החרוז. לכן, מה שאעשה הוא להחדיר את הפרובה מעט עמוק יותר ולפתוח את צינור העצבים, כפי שניתן לראות שעשיתי שם. אני אבצע כעת הגדלה כדי לראות מקרוב יותר.אני רק משנה מעט את המיקוד כאן. ואפשר לראות שיש שם פתח קטן ויפה, אבל לא באמת יצרתי חור מעל המקום שבו נמצא ה-cephalon של הזנב, וזאת משום שהחרוז ימוקם שם. לכן, איני רוצה שיהיה חור שדרכו החרוז עלול לצוף החוצה.אני רוצה למקם זאת מעט אחורה, כדי שאוכל להכניס את החרוז ולדחוף אותו קדימה. כעת אני אקח חרוז. ניתן לראות שישנם גדלים שונים רבים.אלה הם חביבי אקרילי עם הפרין, הם נמצאים ב-PBS. אני אשתמש בפינצטה 55. כפי שניתן לראות, אני אכנס ל-PBS ואבחר אחד שמתאים לי.ברגע שזה יוצא מה-PBS, זה בדרך כלל נדבק לפינצטה, אפשר לראות את זה שם. המשיכו לכסות את החרו지를. החזירו לי את הביצה.אני אכוון את הפוקוס על הביצית. לכן, אני אעביר את החרוז באמצעות פינצטת 55. הוא נמצא מעט גבוה יותר על הפינצטה ממה שאני מעדיף, אבל הנה הוא.ועכשיו אני פשוט אכוון את זה אל החור שפתחתי בצינור העצבי. ברגע שאספיג את זה בתוך הצינור העצבי, יהיה קל יותר להנחית את זה לכיוון החלק הקדמי של המוח המתפתח. לכן אני אשתמש בחוט הטונגסטן שלי כדי פשוט לדחוף את זה.בעת הנחת החרוז ב-cephalon, יש לנהוג בזהירות, שכן עם התפתחותו של העובר, הוא יתחיל להתכופף קדימה ואז הצידה. במקרים רבים, כאשר מניחים חרוז במוח הקדמי (cephalon), הוא נוטה ליפול לכיוון המקור, מכיוון שהמקור נוצר בחלק הוונטרלי של העובר בעוד שהמוח נמצא באזור הדורסלי. אך זה נראה טוב למדי.אני די שבע רצון מזה. אני אמשיך כעת, אקח פיפט עם 10 µL של PBS סטרילי, ואני פשוט אטפטף מספר טיפות כאן. אוקיי, עכשיו אנחנו יכולים לסגור את הביצה.כעת אעלה את החלון לכאן, למעלה ומעבר, והביצה עדיין אינה אטומה. לכן, כדי שהיא לא תתייבש, אקח חלק מסרט ההדבקה הפלסטי שהשתמשנו בו ואגזור חתיכה. היא צריכה להיות בערך בגודל של החלון, רק מעט גדולה ממנו.אני אמטח את זה מעט, ואני אמקם את זה בדיוק מעל החלון כאן ואוודא שזה הדוק היטב. כך, כל החורים שיצרנו, בין אם בזמן ניקוז האלבומין או בחיתוך החלון, יהיו אטומים. כעת הביצה אטומה, היא לא יכולה לאבד מהאלבומין והיא לא תתייבש.הוא אמור להיות מסוגל להזדקן באופן נורמלי. זהו זה לגבי מיקום החרוזים. בהצלחה בניסויים עם האפרוחים, ואני מקווה שקיבלתם את התוצאות שרציתם.

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים שתי שיטות להכנת והצבת חרוזים, אשר היה מצופה גורם הגדילה, על explants של קליפת המוח המתפתח. חרוזים אלה יכולים לשמש כדי לעורר ביטוי גנים מוגבל מרחבית על פיתוח רקמות עצביות כגון explants forebrain. שיטות ניתנים לשימוש הן Affi-Gel חרוזים חרוזים acryllic הפרין.

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

מאמר זה מתאר תיוג פני...

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).

מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

על ידי השתלת חרוזים ספוגים בגורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות לעוברים מתפתחים, ניתן לבדוק ישירות את השפעותיהם in vivo. בפרוטוקול זה מושתלים חרוזים בניצן הגפה כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות אלו על ביטוי גנים והעברת אותות.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

מתוארים פרוטוקולים המשתמשים במחסומים אטומים לחסימת אירועי אינדוקציה בין רקמות ציר הגוף הראשי והצד בעובר הגוזל הנדרשים להיווצרות גפיים. חרוזים ספוגים באותות אינדוקטיביים מועמדים משמשים להתגברות על ההשפעה של מיקום מחסום וניתוח ביטוי גנים מאשר זאת.

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה לתרבית עוברי אפרוחים ex ovo להדמיית זמן-lapse באמצעות אור מועבר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כריך נייר הסינון השקוע הוא גרסה של טכניקת נושא נייר הסינוןהמבוססת 1 המאפשרת גידול של עוברי אפרוחים שקועים במלואם במדיום תרבית נוזלי.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך אקס אובו זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ'יק עובר

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

למדו שיטת in ovo להצבת חרוזים מצופי פקטור צמיחה בעוברי תרנגולת בשלב E2.5. שיטה זו מאפשרת לחקור את השפעת פקטורי הצמיחה על גורל התאים בביולוגיה התפתחותית.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

גלה סרטונים נוספים