שימוש בהכלאה פלואורסצנטית של Immuno-RNA באתרו כדי להמחיש את SARS-CoV-2

קחו לדוגמה תאי Vero קבועים וחדירים הנגועים בנגיף הקורונה - קו תאי יונקים חסר אינטרפרון.

בתוך המארח, RNA ויראלי קיים כ-subgenomic או sgRNAs, מולקולות RNA באורך בינוני המקודדות חלבונים נגיפיים ספציפיים המסונתזים באמצעות שעתוק.

הוסף תגובת שרשרת הכלאה או בדיקות יוזם HCR.

בדיקת ה-HCR נקשרת לרצף המשלים שלה ב-RNA המטרה.

הציגו בדיקות סיכת ראש אוליגונוקלאוטידים עם תווית פלואורסצנטית, H-1 ו-H-2.

הגשושית היוזמת נקשרת לזנב ה-H1 המשלים שלה, והופכת את מבנה סיכת הראש ליניארית.

רצף H1 שנחשף נקשר לזנב H2 המשלים שלו.

רצף H2 הנגרר ממשיך להיקשר לזנב H1, מגביר בדיקות מתויגות פלואורסצנטיות סביב אזור המטרה, ויוצר אות חזק.

הוסף נוגדנים מתאימים כדי לדמיין את השלד הציטולוגי של התא המארח.

מכתים את הגרעינים באמצעות DAPI.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תאים נגועים בנגיף מציגים פלואורסצנטיות אדומה בציטופלזמה, מה שמעיד על נוכחות ה-RNA המטרה.

לאחר קיבוע וחדירה של התאים, כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, הסר את תמיסת ה-PBS 1x מהבארות, והוסף לפחות 300 מיקרוליטר של מאגר הגברה לכל באר. דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הכן כל סיכת ראש HCR על ידי קירור מהיר של הנפח הרצוי בצינורות נפרדים.

להכנת 300 מיקרוליטר של תמיסת הגברה, השתמש ב -18 פיקמולים מכל סיכת ראש. העבירו את תמיסת סיכת הראש לשפופרות, ודגרו אותן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר מכן, מצננים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. הכינו תערובת סיכות ראש על ידי הוספת סיכות השיער H1 ו-H2 שהתקררו במהירות למאגר ההגברה. יש להניח טיפות של 30 עד 50 מיקרוליטר של תערובת סיכות ראש על פרפילם, ולדגור על הדגימות למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר.

כדי להרכיב את השקופיות, הנח שתי טיפות של 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על מגלשה, וודא שהטיפות מופרדות מספיק כדי לאפשר להניח שתי החלקות כיסוי על שקופית אחת. הסר עודפי נוזלים על ידי הקשה על הכיסויים על מגבת נקייה. לאחר מכן, הנח אותם במדיום הרכבה נגד דהייה כשהתאים פונים כלפי מטה. הניחו את הדגימות המותקנות על משטח שטוח ויבש בחושך ותנו להן להתרפא.