Name: עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: חקור אנגיוגנזה דה נובו ברקמת ממברנה ויסרלית של עכברושים בוגרים באמצעות מודל חלונות המזנטריום. שיטה זו מאפשרת מדידות כמותיות של צפיפות כלי דם ודפוסי התפשטות לחקר מחלות סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תמיכה כספית עבור רוב המחקרים סופק על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (מענק 5942).

1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכרסמים קטנים, כגון חולדות, עכברים, שרקנים, שימשו במודלים של בעלי חיים. למרבה הצער, עכברים בוגרים (זנים עכבר רבים כבר העריכו) נוטים חוסר או יש רק מספר נמוך מאוד של פוטנציאל הוריות microvessels (שממנה יכולה לנבוע אנגיוגנזה) בתוך חלונות mesenteric שלהם, מה שהופך את לימודי באמצעות עכברים אמין. לכן, assay פותחה בעיקר חולדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החולדות, אשר התאקלם לסביבה תקן לפחות 7 ימים לאחר הלידה מתוך המגדל, הם שוכנו בדרך כלל בכלוב סטנדרטי בזוגות תחת מחזור אור / חושך 12 שעות עם גישה חופשית למים כדורי. כל חיה מסומן. אנו משתמשים בעיקר חולדות מבוגרים צעירים (בדרך כלל 7-10 שבועות של גיל של זנים שונים, אך בדרך כלל זכר Sprague-Dawley חולדות; אצל חולדות צעירות יותר 5-6 שבועות של גיל מספר microvessels יליד נוטה להיות נמוך) המתקבל מגדלים שונים. בתקופה לפני הניסוי ובמהלך הניסוי, החיות הם שקלו כל יום שני, תמיד ביום של הקרבה. כאשר בעלי החיים מטופלים ip במקביל (לזירוז של אנגיוגנזה, ראה להלן) או sc iv או פו, הם שקלו כל יום. זה מאפשר הקמת קבוצות הניסוי והבקרה של משקל הגוף שווה בתחילת הניסוי, ומאפשר ניטור של השפעת הטיפול על הגוף, משקל לזכות במהלך הניסוי. מאז חולדות זכרים בוגרים לגדול וחסונה פיזיולוגית (צובר כ 40-60 גרם בשבוע, תלוי בסוג של מתח), משקל לזכות פיגור הוא סמן רגיש תחליף של רעילות, מערכתיות רווחה, אנורקסיה, וכישלון לשגשג. </li></ol> אנחנו עובדים מתקן ברמה גבוהה טיפול בבעלי חיים מאמצים רבים נעשים כדי לצמצם את רמות הלחץ שחווים בעלי החיים. קווים מנחים אתיים הנוכחי הם אלה שהקימו וורקמן פ et al. (הנחיות לרווחת ואת השימוש בבעלי חיים בחקר הסרטן. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת גטבורג אישרה את המחקרים הללו. 2. Pro-angiogenic intraperitoneal טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעד מועמד angiogenic גורם להיבדק הוא מומס בדילול מלא מלוחים, רעלן פנימי חינם המשמש עירוי של חולים (אפילו ברמות נמוכות מאוד, הוא רעלן פנימי הפרו angiogenic). כל הפתרונות בנויים טרי ביום ההזרקה, סטרילי, מסוננים (Millipore 0.22-מיקרומטר סינון), בדק את ה-pH נייטרלי (7.1-7.3), והשתמש בטמפרטורת החדר. סוכן הבדיקה מוזרק בריכוזים נמוכים או נמוכים מאוד. לדוגמה, החולדה rVEGF 164 (564-RV/CF; מו&quot;פ מערכות אירופה בע&quot;מ, Oxon, בריטניה), המהווה את VEGF-A השולט איזופורם בחולדות, הוא מדולל ל pmole 96 / מ&quot;ל מלוחים רעלן פנימי חינם, קפוא ו מופשר נפח של 5 מ&quot;ל מוזרק לתוך ה-IP החולדה. אנו משתמשים מזרק 5 מ&quot;ל עם מחט 0.8 מ&quot;מ (מחט ירוקים, 21G) להזרקה ip. טיפול זה, בהתחשב פעמיים ביום למשך 4.5 ימים, כלומר. מ שני בבוקר (יום 0) עד יום שישי בבוקר (יום 4), גורם לתגובה חזקה אנגיוגנזה הנבטה ברקמת מבחן mesenteric, שבשיאה הגיעה ל 21 יום מסביב. ניהול ה-IP הפתרון מבטיח כי נפח כולו מועבר לתוך חלל הצפק (ולא לתוך שלפוחית ​​השתן, המעיים או כל איבר אחר). הזרקה מהירה של 5 מ&quot;ל מאפשר מישוש אישור על ידי המפעיל כי סילון הנוזל עבר דרך דופן הבטן לתוך חלל הבטן. בהמשך, לפני או במקביל לטיפול הפרו angiogenic ip, סוכן בכל מבחן של הבחירה יכול להינתן באופן מערכתי. </li></ol> 3. Administation מערכתית של אנגיוגנזה-ויסות סוכנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיב אחר מלבד דרך ה-IP יכולה לשמש, שכן טיפול ip עשוי להשפיע על תגובת angiogenic מתמשך באמצעות אינדוקציה של דלקת או אולי על ידי הפעלת תא הפיטום ברקמות הבדיקה, אשר יכול להוביל לתגובה הפרו angiogenic חזק. מלבד אוראלית או בהזרקה sc יחיד או iv, אנו מרבים להשתמש sc הממשל באמצעות minipumps אוסמוטי (אחד או יותר, עם כמויות משתנות ושאיבה פעמים) כדי לספק את הפתרון בקצב קבוע לתקופה של עד שנתיים או מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינפוזיה תת עורית ממושכת של סוכנים מבחן מילוי השתלת minipumps האוסמוטי בדרך כלל ב 5 יום, כלומר יום אחד לאחר סיום הטיפול VEGF ip, minipumps אוסמוטי (לדוגמה, דגם 2ML2, עם קצב שאיבה קבועה של 5.0 μl / שעה במשך 14-15 ימים; משאבות אוסמוטי Alzet, Mountain View, CA , ארה&quot;ב) מלאים בתנאים סטריליים עם סוכן הבדיקה או את הרכב המתאים. לאחר אחסון סטריליים 0.9% (w / v) NaCl לילה בשעה 37 ° C, את המשאבה (ים) מושתל בניתוח sc על הגב (בצד של colu השדרהmn באזור השכמות) של חולדות שהיו בהרדמה באמצעות גז isoflurane (Isoba וטרינר, שרינג פלאו לבריאות בעלי חיים, Merck &amp; Co, Inc, Whitehouse Station, ניו ג&#39;רזי, ארה&quot;ב), תחילה בחדר שקוף אטום ו לאחר מכן באמצעות מסכה (כדי לצמצם את הלחץ שנגרם לבעל החיים הבא, החדר הוא הסמיק עם אוויר לפני שהוא בה שימוש חוזר). החתך בעור עשה עבור השתלת המשאבה הוא sutured מיד לאחר ההשתלה באמצעות חוט משי. מאז החיות במשקל פיזיולוגית במהלך תקופת הניסוי סוכני הבדיקה ניתנות בקצב קבוע, המינון שנבחר בפועל עבור התרופה מבחן לכל ק&quot;ג משקל גוף גבוה יותר מאשר המינון הממוצע בתחילת התקופה עירוי נמוכה מאשר המינון הממוצע בסוף התקופה עירוי. עירוי רציף, כפי שתואר כאן, ניתן לראות בצורה ממושכת של טיפול מטרונום. </li></ol> 4. סיום הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיה אחת בכל פעם מושם בתא אטום ושקוף, אשר סמוקות עם גז CO 2, אשר במהירות הורג את בעלי החיים. החדר הוא הסמיק עם אוויר לפני בשימוש שוב. </li></ol> 5. רקמות דוגמאות קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שניתן לראות ב-DVD, דופן הבטן היא פתחה את mesentery קטן בבטן מזוהה, כולל החלק הדיסטלי ביותר המגיעה שסתום ileo-cecal (בצומת של המעי הדק למעי הגס). ארבעה (או יותר) של רוב ממוקם distally &quot;חלונות&quot; ממוספרים, להפיץ על המטרה Superfrost מטופל רגיל פלוס שקופיות (DAKO דנמרק A / S, Glostrup, דנמרק). חשוב להימנע, במידת האפשר, זיהום עם דגימות דם, תוכן המעיים או נוזלי גוף אחרים, כמו חומרים אלה עשויים להיות מוכתם לא במיוחד, אם כי זה לא לפסול את להדמיה immunohistochemical הבאות של microvessels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימה לכל חלון mesenteric עם קטע מעי המצורפת קטן מתפשט בשקופית מיובשים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. ואז, גדם המעי מנותקת, ואילו דגימות שלם mesentery קרומי מאוחסנים ב -20 ° C לפרקי זמן ממושכים. זו מוצגת ב-DVD. </li></ol> יצוין כי vasculature רקמות פטנט ניתן דמיינו לפני הקציר עם מיקרוסקופיה מועבר intravital אור. 6. פרוטוקול מכתים immunohistochemical של Microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 דגימות מותר להפשיר מ -20 ° C לטמפרטורת החדר, מיובשים בארון ב 60 ° C עבור 1 שעה, ושמרו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 מניחים את השקופיות מכתים מחזיקי שקופיות (במסלול בכל שנייה) בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.8) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון הוא מושלך ובמקומו לפתרון הבא, וכן הלאה עבור כל השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין טיפול מלאו את הצנצנת מכתים כי יהיה הנמל מחזיק שקופיות מכתים עם פתרון טריפסין (25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). מחק את הפתרון ואת לדגור פעמיים עם פתרון סוכרוז 2.5% (בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בכל פעם). מחק את הפתרון ולשטוף כמה פעמים אקווה DEST (בטמפרטורת החדר במשך כמה דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת מלאו את הצנצנת מכתים כי יהיה הנמל מחזיק שקופיות מכתים עם 0.5% H 2 O 2 ב מתנול (בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות). מחק את הפתרון ולשטוף עם אקווה DEST (בטמפרטורת החדר במשך כמה דקות). מחק את הפתרון ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) (בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Incubations כל בתא humidified בטמפרטורת החדר. כ 150 μl של כל אחד הפתרונות המפורטים להלן משמשים לכל שקופית. השקופיות ממוקמים בתא humidified ואת הפתרונות הם pipetted אל דגימות (הלא קרומי חלקים לא צריך להיות מכוסה על ידי הפתרונות). עבור כל אחת מהפעולות הבאות, בזהירות להתנער כל פתרון לפני הפתרון לאחר מכן הוא הוסיף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רגיל (חסימה) בסרום (סוס) (ABC בערכה) 3 טיפות פתרון צהוב / 10 מ&quot;ל דילול חיץ במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני ARU0181, אשר תוויות וסקולרית עכברוש לתאי אנדותל. הנוגדן הוא מדולל 1:600 ​​עם חיץ דילול (Biosource) (100 μl מדולל פי 40 [קפוא] בתוספת 900 חיץ דילול μl) ו הדגירה מתרחשת בן לילה ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 מגלשות יוסרו מן החדר humidified, הנוגדן העיקרי נמחקת, וגם את השקופיות ממוקמים בעל מכתים שקופיות, אשר שקוע בצנצנת מכתים ושטף פעמיים עם כפות(PH 7.8) במשך 8 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן biotinylated (ABC ערכת) השקופיות מונחות אופקית בתא humidified ו מודגרות עם ירידה של 1 פתרון כחול / 10 מ&quot;ל דילול חיץ במשך 30 דקות. מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות בעל מכתים שקופיות שקוע בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם ריאגנט ה-ABC מגלשות ממוקמות שוב אופקית בתא humidified ואת הפתרונות הבאים pipetted על החלקים קרומי דגימות: 2 טיפות של תמיסת כתום בתוספת 2 טיפות של חום פתרון / 10 מ&quot;ל כפות (pH 7.4) במשך 30 דקות. מערבבים היטב 30 דקות לפני השימוש! מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות מחזיק את השקופית בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) במשך 8 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים עם DAB (0.05%) צעד זה חייב להתבצע במנדף כימי מאוורר! מניחים את שקופיות ולהוסיף את 3,3-diaminobenzidine (DAB; סיגמא אולדריץ &#39;) פתרון בעזרת פיפטה: פתרון DAB 0.1% ב TBS (pH 7.4) [קפוא] הוא מדולל 01:01 בתערובת של 10 μl H 2 O 2 ו - 7.5 מ&quot;ל כפות (pH 7.4). פתרון זה רק סטרילית, מסוננים לפני השימוש (לחסל את כל חלקיקי שעלולים לטשטש את התמונה המיקרוסקופית). הכתם דגימות במשך 8 דקות. מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות מחזיק את השקופית מכתים שקוע בצנצנת מכתים. לשטוף תחת זרם מי ברז ולאחר מכן אקווה DEST במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות מגלשות נשמרים מחזיק את השקופית מכתים. שטפו על ידי השלכת ומילוי מכתים את הצנצנת המכילה אקווה DEST / אתנול: אקווה DEST, אלכוהול 70%, 95% אלכוהול, אלכוהול מוחלט, עם 2 דקות כל פתרון. </li></ol> 7. הדמיה הערכת רשת כלי הדם של הדגימה כל חלון mesenteric לאחר מכתים immunohistochemical של כלי הדם לתאי אנדותל כפי שמוצג בסרט, microvessels הם מיקרוסקופית דמיינו באתרו ברקמה ללא פגע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, אנו משתמשים במיקרוסקופ ציור עם טווח הגדלה 14-34 (Leica M Wild 3Z) כדי עפרון על נייר לבן את אזור החלון כולו, כמו גם את האזור כולו vascularized (VA) לכל חלון mesenteric. VA, כאחוז האזור כולו, נמדדת בקלות באמצעות planimetry ממוחשב או לא ממוחשב (או פשוט על ידי חיתוך החוצה שקלול את התמונה של החלון כולו, את התמונות של כל vascularized שלה חלקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ עוד ציור, פרופילים microvessel בודדים, אשר מזוהים בקלות, מצוירים בדיו שחור על נייר לבן בהגדלה 80 בתוך שדות שנבחרו באקראי. זוהי נקודת המוצא של הערכה שלאחר מכן morphometric ממוחשב של אורך כלי הדם (MVL), אשר היא בעצם מדידת צפיפות כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, משתנים הקשורים להיווצרות דפוס כלי הדם, כמו גם להערכה של מספר נבטים כלי הדם ואורך נבטים כלי הדם היחיד (מס &#39;SP ו-Le. SP, בהתאמה) ניתן לקבוע. -הניגוד אופטימלי בין המבנים המתוארים כלי שחור על רקע לבן מקל ניתוחים מפורטים של התמונות מסחרי תוכניות ממוחשבות morphometric ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברוב המקרים, את המשתנים העיקריים הם VA ו MVL, אשר מוכפל כאשר יחד ליצור את אורך כלי הדם הכולל (TMVL). </li></ol> 8. ניתוח סטטיסטי בדרך כלל אנו משתמשים בתקן הלא פרמטרית Mann-Whitney U-מבחן לנתח מזווג (שני זנב) תצפיות. ממוצע של ארבעה חלונות mesenteric לכל חיה משמש העצמאי נתונים נקודות עבור כל משתנה של חלון mesenteric. הקריטריון של מובהקות סטטיסטית הוא P ≤ 0.05.

<ol><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+testing+with+angiogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li>
<li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast-cell-mediated+angiogenesis%3A+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B+Cell.+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li>
<li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+meteronomic+chemotherapy%3A+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li>
<li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp, T. uneberg, S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF%28165%29-mediated+angiogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li>
<li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalteparin%2C+a+low-molecular-weight+heparin%2C+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res.%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay הוצג בשנת 1986 ויש לו 3 ברציפות פותחה עוד ומעודן במעבדה שלנו 7,10-12. כפי שנאמר בעיתונים ביקורת (מוזמן) 1, 2, assay משווה גם עם יונקים אחרים assay אנגיוגנזה vivo ביחס במיוחד תכונות חשובות כגון רקמת המבחן למבוגרים הוא מקורי vascularized וחסר אנגיוגנזה פיזיולוגי; טראומה מינימלית, אם בכלל, היא שנגרם לרקמות; משתנים כמותיים נמדדים באמת, המאפשר ניתוח סטטיסטי קול לגבי מנה תגובה ופעילות מולקולרית מחקרים; אנגיוגנזה נביטה מתרחשת, אשר predominating ברקמות גידולים רגילים; נתוני רעילות מצטברים בקלות חולדות לגדול וחסונה פיזיולוגית בבגרות. תכונות נחות עשוי לכלול את העובדה assay הוא יחסית זמן רב, במיוחד כאשר בהערכת מספר ואורך מקטעי microvessel הפרט נבטים microvessel, כי הוא אינו מאפשר תצפיות real-time/serial, וכי הוא מתאים כמעט עבור עכברים מאז חלונות mesenteric רבים בעכברים חוסר microvessels הורה פוטנציאל נימים חדש שממנו יכול לנבוע. בזמן אמת תצפיות, עם זאת, מופעל על ידי מיקרוסקופיה intravital שבו חלונות mesenteric exteriorized אבל שלמים הם פרושות מעל הבמה מיקרוסקופ בעוד החיה מורדמת, כפי שפורט 1. התקדמות משמעותית במחקר אנגיוגנזה הושגו בעשורים האחרונים באמצעות מודלים כגון micropocket הקרנית, קרום חומוס chorioallantoic ו sc מבחני Matrigel תקע, אשר הם כלי שימושי אבל בסופו של דבר מוגבל. יישומים קליניים עתידיים של טיפולים אנטי angiogenic ופרו angiogenic מחייבים הקמת ואימות של יותר רגיש ורלוונטי מבחינה ביולוגית, טרום קליניים במודלים כמותיים באמת, כמו זה המתואר בדו&quot;ח הנוכחי.

Buffers ו ריאגנטים 0.5 מ &#39;טריס-HCl (pH 7.8) מניות פתרון טריס (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 גרם) מומס ~ 900 מ&quot;ל אקווה DEST ו ~ 45 מ&quot;ל של HCl 25% (מרוכזת) נוסף כדי להשיג את ה-pH 7.8 בעקבות דילול 1 ליטר עם אקווה DEST. טריס-חיץ מלוחים (TBS; pH 7.8) עד 200 מ&quot;ל של תמיסת המניות הוא הוסיף 18 גרם NaCl מומס ~ 1800 מ&quot;ל אקווה DEST עם התאמה של עד 7.8 pH באמצעות פתרון המניות, בעקבות דילול עד 2 ליטר עם אקווה DEST. TBS (pH 7.4) עד 200 מ&quot;ל של תמיסת המניות הוא הוסיף 18 גרם NaCl מומס מומס ~ 1800 מ&quot;ל אקווה DEST עם התאמה של עד 7.4 pH באמצעות פתרון המניות, בעקבות דילול עד 2 ליטר עם אקווה DEST. טריפסין פתרון (0.05% טריפסין, 0.1% CaCl 2) מכיל 0.1 גרם ו 0.2 גרם טריפסין CaCl 2 ב 200 מ&quot;ל כפות (pH 7.8). סוכרוז פתרון 2.5% מכיל סוכרוז 5 גרם 200 מ&quot;ל כפות (pH 7.8). במלאי פתרון של אזיד הנתרן 1% TBS (pH 7.4) מכיל 1 גרם Na-אזיד ב 100 מ&quot;ל עם TBS (pH 7.4). דילול חיץ: 0.1% BSA, 0.01% Na-אזיד (משמש לדלל נוגדנים Vectastain ערכת ה-ABC). מכיל 0.1 גרם אלבומין בסרום שור (BSA) ו 1 מ&quot;ל של 1% Na-אזיד, בדילול מלא עד 100 מ&quot;ל עם TBS (pH 7.4). ABC ערכת Vectastain PK 4002, ABC peroxidase עכבר IgG סוס בסרום רגיל; חסימת בסרום; פתרון צהוב: 3 drops/10 חיץ מ&quot;ל דילול. נוגדן Biotinylated; אנטי עכבר IgG, פתרון כחול: 1 drop/10 חיץ מ&quot;ל דילול. ABC-מגיב: פתרון תפוז, 2 טיפות פלוס פתרון חום 2 כפות drops/10 מ&quot;ל (pH 7.4). מיקס פתרונות אלו 20 דקות לפני השימוש! עכבר (חד שבטי) נגד חולדה האנדותל (Biosource הבינלאומי, Camarillo, קליפורניה, ארה&quot;ב) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קטלוג # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> נוגדן זה מכוון נגד כל לתאי אנדותל כלי הדם של החולדה, למעט אלה במוח. Vectastain peroxidase Avidin קומפלקס ביוטין (ABC) ערכת הערכה מכילה נוגדן ראשוני, נוגדנים משני biotinylated, avidin-biotinylated מורכבים אנזים (ABC), ואת המצע האנזים. ראה <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> או <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> בפרוטוקולים. שור בסרום אלבומין (BSA) (סיגמא אולדריץ, קטלוג # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-Diaminobenzidine Isopac (סיגמא אולדריץ, קטלוג # D 9015). טריפסין מלבלב שור (סיגמא אולדריץ, קטלוג # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-Kit, עכבר IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, שבדיה)

עכברוש mesentery assay אנגיוגנזה

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

העכברוש מבוגר mesentery חלון assay אנגיוגנזה מתאים מבחינה ביולוגית מתאים באופן יוצא מן הכלל ללימוד הנבטה אנגיוגנזה in vivo [ראו ניירות ביקורת], המהווה את טופס שולט של אנגיוגנזה בגידולים אנושיים שאינם סרטניים ברקמות, כפי שפורט ביקורת מוזמן ניירות 1,2. אנגיוגנזה המושרית בחלקים mesenteric קרומי בזריקה (IP) intraperitoneal של גורם הפרו angiogenic יכול להיות מווסתת על ידי תת עורית (SC), תוך ורידי (iv) או דרך הפה (PO) טיפול עם סוכני שינוי של בחירה. כל חלק של קרומי mesentery הוא שקוף ממוסגר על ידי רקמת שומן, זה נותן מראה חלון דמוי. Assay יש את התכונות יתרון הבאים: (i) את הרקמה הבדיקה vascularized מקורי, אם כי בדלילות, ומאז הוא דק מאוד, רשת microvessel הוא כמעט דו מימדי, אשר מאפשר את הרשת כולה כדי להעריך מיקרוסקופית באתרו: ( ii) בחולדות המבוגר רקמות מבחן חסר אנגיוגנזה פיזיולוגי משמעותי, המאפיינת נורמלי ביותר ברקמות יונקים בוגרים, מידת כלי הדם המקומיים, עם זאת, בקורלציה עם הגיל, כפי שפורט 1 (iii) את רמת זניח של אנגיוגנזה טראומה הנגרמת מבטיחה רגישות גבוהה, (iv) assay משכפל את המצב הקליני, כפי אנגיוגנזה-ויסות תרופות הבדיקה ניתנות מערכתית ותגובות הנצפה משקף את ההשפעה נטו של כל חילוף החומרים, הסלולר, ושינויים מולקולריים הנגרמת על ידי הטיפול, (v) assay מאפשר הערכות אובייקטיביות, משתנים כמותיים משוחדת של הרחבה מרחבית צפיפות כלי הדם, דפוס הקמת הרשת, כמו גם של נימי הנבטה, ובכך מאפשרים ניתוחים סטטיסטיים חזקים של השפעה במינון מולקולרית מבנה פעילות יחסי; (ו ) assay מגלה עם רגישות גבוהה את ההשפעות הרעילות של טיפולים או מזיק במונחים של שיעור ירידה של הגוף לצבור משקל פיזיולוגי, כמו חולדות מבוגר לגדול וחסונה. תורן תאים בתיווך אנגיוגנזה הודגם הראשון באמצעות assay זה 3,4. המודל מדגים רמה גבוהה של הפליה לגבי המינון אפקט היחסים ואת ההשפעות של נמדדת באופן מערכתי כימית או תפקודית תרופות וחלבונים קשורה קשר הדוק, כולל: (i) במינון נמוך, מנוהל כמו מטרונום chemotherapeutics סטנדרטי תשואה מגוונים, תרופה ספציפית השפעות (כלומר, פעילויות אנגיוגנזה-מדכאים, ניטרלי או אנגיוגנזה מגרה 5), (ii) טבעי ברזל בלתי רוויות לקטופרין אנושי, המעורר VEGF-A-6 אנגיוגנזה בתיווך, וטבעי ברזל בלתי רוויות שור לקטופרין, אשר מעכב VEGF-A- אנגיוגנזה בתיווך 7; (iii) נמוך משקל מולקולרי שברים הפרין המיוצר על ידי אמצעים שונים 8,9. יתר על כן, assay הוא מתאים מאוד מחקרים על ההשפעות המשולבות על אנגיוגנזה של סוכנים אשר מנוהלים בצורה מערכתית במקביל או רציפים. הרעיון של הפיכת הווידאו הזאת שמקורה המנוח ד&quot;ר יהודה פולקמן כאשר ביקר במעבדה שלנו עדים מתודולוגיה שמפגינים. סקירת עיתונים (מוזמן) לדיון בהערכת assay Norrby, ק במודלים vivo של אנגיוגנזה. J. Cell. מול. מד. 10, 588-612 (2006). Norrby, בדיקות ק והתרופות עם מודלים אנגיוגנזה. מומחה Opin. והתרופות. וגיליתי. 3, 533-549 (2008).

הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

בדיקת בבחינת עקידת קרומי הבטן (mesentery) של חולדה בוגרת לצורך מדידת ביווירה (angiogenesis) היא הולמת מבחינה ביולוגית ומתאימה באופן יוצא דופן למחקר של ביווירה מסוג נביטה (sprouting angiogenesis) ב...

ברוכים הבאים למחלקה הפתולוגית בבית החולים האוניברסיטאי GaN בגוטנבורג, שוודיה. אני ד"ר קלאוס נורבי, והשיטה שאתם עומדים לראות פותחה במעבדה שלי. אנגיוגנזה בעלת רלוונטיות קלינית, המתרחשת בקשר להיפוקסיה, גידולי גרורה או כל מחלה אחרת של אנגיוגנזה, מתרחשת כמעט אך ורק ברקע עם כלי דם טבעיים. במכרסמים קטנים בוגרים, המזנטריום (קרום המעי), המחבר את המעי הדק לדופן האחורית של הגוף, מכיל מספר חלקים קרומיים דקים. בחולדות ישנם כ-40 עד 50 מחלונות מזנטריים אלו. הם שקופים למעשה ולכן נראים כחלונות לעין הבלתי מזוינת, כאשר כל חלון מוקף ברק adipose (רקמת שומן) בחולדות זכר בוגרות.החלונות המזנטריים (mesenteric windows) הם בעלי וסקולריזציה טבעית וחסרים אנגיוגנזה פיזיולוגית מדידה. לפיכך, הם מספקים הזדמנות לחקור אנגיוגנזה דה נובו (de novo) ברקמה של יונקים עם וסקולריזציה טבעית בבגרות. כלומר, יצירת תגובה אנגיוגנית מלאה מאפס, תוך התגברות על מעכבי האנגיוגנזה הפועלים באופן אנדוגני ברקמת הבדיקה כפי שקורה בכל הרקמות הנורמליות בעכברים; כלי דם זעירים טבעיים שיכולים לשמש ככלי דם זעירים הורים חסרים בחלק מהחלונות, מה שלמרחב הופך את הבדיקה לבלתי צפויה בעכברים במצבה הטבעי.חלונות המזנטריום (mesenteric windows) בחולדות מכילים בדרך כלל מספר קטן יחסית של כלי דם קטנים הממוקמים בפריפריה בחולדות בוגרות. חלונות מזנטריים אלו הם בעביה טבעית של חמישה עד 10 מיקרומטרים בלבד. דבר זה מאפשר לפרוס רקמה שלמה על עלויות (slides) ולבחון אותה מיקרוסקופית, ובכך ניתן לצפות בכל כלי הדם בכל חלון, מהמעניק לכלי הדם למעשה הרחבה דו-ממדית.השיטה מציעה הזדמנות חסרת תקדים לביצוע מדידות כמותיות של ההתרחבות המרחבית, הצפיפות, תהליך היווצרות התבניות והגודל של מיקרו-כלי דם. האתר התת-עורי פופולרי למחקרי אנגיוגנזה, עם זאת, בשל הטרוגניות של תאי אנדותל ותכונות ספציפיות של הרקמה, שליטה על אנגיוגנזה ברקמות תת-עוריות ובגידולים הגדלים באופן תת-עורי עשויה שלא לנבא שליטה על אנגיוגנזה וגרורות באיברים ויסרליים כגון הריאות, הכבד, העצם והמוח. נקודה זו ראויה לציון, כיוון שגרורות ויסרליות הן בדרך כלל האחראיות הסופיות לקטלניות של הסרטן.העובדה שחלון המזנטרי הוא visceral אמורה להוות יתרון בהקשר זה. מטרת הפרויקט שלנו היא לבחון היבטים של angiogenesis דה-נובו באופן כמותי. לפיכך, אנו מזריקים גורם פרו-אנגיוגני מוכר או חומר לבדיקה באופן אינטraperitoneal.בדרך כלל אנו מזריקים חמישה מיליליטר בכל פעם לחולדות בוגרות שאינן תחת הרדמה. נפח כזה חושף במהירות את כל המזנטרום (קרום המעי) לנוזל המוזרק. כל תמיסה המוזרקת תוך-פריטונית, ובלבד שנפחה אינו זניח, אמורה להשפיע על כל התאים ברקמת הבדיקה, במיוחד מכיוון ששכבת תאי המזותליום המכסה את חלון המזנטרום הדק ביותר היא חדירה מאוד לממסים. כיוון שלא נדרשת התערבות כירורגית, האנגיוגנזה הנבדקת בחלון המזנטרום אינה מושפעת מאנגיוגנזה המושרה על ידי ריפוי פצעים, ולכן הטיפול האנגיוגני ניתן בצורת זריקות תוך-פריטוניות.מסיבות מעשיות, אנו משתמשים בפרוטוקול טיפול הכולל שתי הזרקות יומיות לאורך תקופה של חמישה ימים, משביעי יום בבוקר עד שישי בבוקר, כפי שנהוג במחקר של השפעות אנגיוגניות של חלבונים מוגדרים כגון VEGF 1 65, 1 64, ו-basic FGF, למשל. בדרך כלל נעשה שימוש בתמיסת עירוי של Pharmacia כנשאי (vehicle). מספר הטיפולים עשוי להיראות גבוה, אך הוכח כי לא תמיד ניתן להשרות אנגיוגנזה בעלת מובהקות סטטיסטית, גם כאשר משתמשים בגורמים פרו-אנגיוגניים חזקים כגון VEGF ו-basic FGF, כאשר אלה ניתנים ברמות פיזיולוגיות בקירוב במינון בודד או במספר מינונים במרווחים, ויש לזכור כי ברקמה פועלים מעכבי אנגיוגנזה אנדוגניים חזקים.מתן שיטות טיפוליות למודולציה של אנגיוגנזה מדמה מצב טיפולי קליני. ניתן להנחית גורם אחד או יותר למודולציה של אנגיוגנזה באופן סיסטמי, תת-עורי, תוך-ורידי או経orally. לדוגמה.מצב זה מדמה סיטואציה של טיפול קליני, בכך שניתן לחקור לא רק את ההשפעה של המולקולה המקורית אלא גם את זו של המטבוליטים שלה. המערכת מאפשרת מידה מסוימת של בקרה על ההשפעות הרעילות של חומרים מווסתים של אנגיוגנזה המוגשים באופן סיסטמי. מכיוון שחולדות בוגרות גדלות פיזיולוגית ומשקלן עשוי לעלות בכ-40% במהלך ניסוי הנמשך שבועיים או שלושה, ניתן להשיג באמצעות שקילת בעלי החיים הבנה של המידה שבה הטיפול עיכב את העלייה במשקל הגוף, דבר שיכול להוות ביטוי להשפעות רעילות.דבר זה מאפשר זיהוי של מינונים רעילים בבדיקות למודולציה של אנגיוגנזה, חומרים שיש להימנע מהם. זהו יתרון חשוב, שכן ייתכן שלא ניתן יהיה לפרש את התוצאות במונחים של השפעות אנטי-אנגיוגניות ספציפיות. אם מעורבת השפעה רעילה, מכיוון שחולדות בוגרות גדלות משמעותית מהר יותר מעכברים בוגרים, השפעתם של חומרים רעילים על עליית משקל הגוף צפויה להוות אינדיקטור רגיש יותר להשפעות רעילות כלליות בחולדות מאשר בעכברים.כעת נרצה להראות לכם כיצד מכינים דגימות של חלונות מזנטריים (mesenteric window). בעלי חיים אלו הרגו באמצעות CO2. החלונות המזנטריים נפרסים על גבי שקופיות רגילות בגודל של שלוש על אינץ' אחד, החל מהחלק הדיסטלי של המזנטריום.לא ניתן להבחין באנגיוגנזה בעין בלתי מזוינת בחלון המזנטרי, החל מהשסתומי האיליו-צקלי ובמרחב של תנועה רטרוגרדית. נעשה שימוש בארבעה חלונות שנאספו מהחלק הדיסטלי ביותר של המזנטרה. הדגימה על השקופית מיובשת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.שורש המעי נגזר. הדגימות נשמרות לאחר מכן במקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. באופן זה, ניתן לשמר את הדגימות למשך מספר חודשים, ואולי אף שנים, ללא ירידה ניכרת באיכותן.הצביעה מבוצעת באמצעות נוגדן מונוקלונאלי נגד אנדותל של חולדה. יש להניח לדגימה להתייבש באוויר, ואין להשתמש בזכוכית כיסוי. הכמות של מופעי כלי הדם בחלונות מזנטריים (mesenteric windows) בודדים נקבעת באמצעות מיקרוסקופיה מורפומטרית מ komputer-aided, תוך שימוש במיקרוסקופ רישום עם הגדלה אופטית כוללת שבין 14 ל-34. כל החלון המזנטרי מוצג ויזואלית.ההגדלה נבחרת בצעדים קבועים כך ששטח רחב ככל האפשר של שדה הראייה יכוסה על ידי הדגימה. כל שטח החלון מצויר בקלות, שכן הגבול בין החלון לרקמה השומנית שמסביבו הוא ברור. לאחר מכן, כל החלקים המvסכולריים מצוירים על פי קריטריונים שהוגדרו בקפידה.ניתן להבחין בבירור אפילו בכלי דם חדשים וקטנים ביותר, שקוטרם בהגדלה גבוהה נמצא כ-2.5 עד 3.0 micrometers. העובדה שקוטרה הממוצע של כדורית דם אדומה של חולדה הוא 6.3 micrometers או יותר, מדגימה עד כמה כלים אלה קטנים. השטח של כל החלקים המכילו כלי דם בחלון, כאחוז משטח החלון כולו, ידוע כשטח הווסקולריזציה היחסי va.מבחינה מעשית, מדובר במדידה של ההשׂתלשות המרחבית של כלי הדם, מאחר שיש להם למעשה התפשטות דו-ממדית; ניתן למדוד את ה-VA בקלות באמצעות טלמטריה בעזרת מחשב, למשל. השלב הבא כולל תיעוד של צפיפות המיקרו-כלי הדם ותבנית ההיווצרות שלהם בתוך שלושה חלקים מרכזיים של האזורים המכילים כלי דם בכל חלון. חלקים אלו נבחרים באופן סיסטמטי ובאקראי בהגדלה אופטית של 80.כל כלי דם מוצג כקו בודד באמצעות מיקרוסקופ רישום. התמונה של כל שדה ראייה מועברת לתמונה דיגיטלית ולמנתח תמונות, ולאחר מכן כל כלי דם בתמונה הדיגיטלית מצומצם לעובי של פיקסל אחד. המכונה מודדת לאחר מכן את מספר הפיקסלים, המייצגים את כלי הדם, והם מבוטאים כשבר מכלל הפיקסלים בשדה הראייה.נתון אחוז זה, אורך המיקרו-כלי דם או MVL, מייצג את אורך המיקרו-כלי דם בכל יחידה של השטח המוגבל בכלי דם, ומהווה מדד מורכב של צפיפות המיקרו-כלי דם. על ידי הכפלת ממוצע ה-VA של ארבעה חלונות לכל חיה בממוצע ה-MVL עבור קבוצת הטיפול התואמת, מחושב אורך המיקרו-כלי דם הכולל לכל חיה, ה-TMVL. בנוסף, פיתחנו טכניקות לניתוח כמיות מפורט של צפיפות והרכב המיקרו-כלי דם באמצעות ניתוח תמונות.אלה כוללים מדידה של המרחק הממשי בין שני כלי דם זעירים עוקבים, נקודות התבססות, כלומר, האורך של כלי דם זעירים בודדים, מקטעי LEMS, מספר כלי הדם הזעירים, מקטעים ליחידת נפח רקמה, NOMS, ומספר נקודות ההתבססות של כלי דם זעירים ליחידת נפח רקמה, NOBP. מידת הפיתול בכלי הדם הזעירים MVT נקבעת על פי ההפרש בין המרחק הקצר ביותר למרחק הממשי בין שתי נקודות התבססות עוקבות, השכיחות של הצטלבות כלי דם זעירים, מדד החיתוך INIS, ויצירת לולאות מקשרות. ניתן למדוד במדויק גם את מדד יצירת הלולאות INLF באמצעות טכניקות דומות בפריפריה של רשת כלי הדם הזעירים.אנו יכולים ponad כן לכמת משתנים תואמים עבור נבטים, כולל אורך נבטים, LESP, ומספר נבטים ליחידת נפח רקמה, NOSP, תוך תכנון ניסויים כיוון שייתכנו הבדלים משמעותיים בין בעלי חיים באותה קבוצת טיפול ואפילו בין חלונות מזנטריים באותו בעל חיים. מצאנו כי התכנון הבא עשוי להיות מעשי: מספר בעלי החיים לכל קבוצת טיפול בזמן התצפית, שמונה עד 12; מספר החלונות לבעל חיים המנותחים במונחי VA; מספר שדות הראייה עבור כל חלון המנותח במונחי אורך מיקרו-כלי דם, MVL; אורך מקטעי מיקרו-כלי דם, LEMS; מספר מקטעי מיקרו-כלי דם, NOMS; מספר נקודות פיצול של מיקרו-כלי דם, NOBP; עקמומיות מיקרו-כלי דם, MVT; מדד חיתוך, I; ומדד להיווצרות לולאות, INF. שלושה בעלי חיים שקיבלו פלסבו (vehicle) משמשים כביקורת. בדיקת האנגיוגנזה בחלון מזנטרי מתאימה היטב למחקרי תגובת מינון ולניתוחים קינטיים של אנגיוגנזה.ניתן לבצע זאת על ידי טיפול בקבוצות של בעלי חיים במינונים שונים של גורם פרו-אנגיוגני והקרבת בעלי חיים אלו בנקודות זמן שונות במהלך התגובה האנגיוגנית. בכך ניתן להבחין במונחים כמותיים בשלב ההרחבה, בשיא ובשלב האנגיו-רגרסיבי העוקב. מחקרים מסוג זה גילו כי התגובה האנגיוגנית ה-de novo לכל ציטוקין של גורם גדילה שנבדק היא תלויה במינון באופן ספציפי מבחינת המהירות, העוצמה והמשך.יתר על כן, דפוס כלי הדם החדשים, במונחים של התפשטות מרחבית ושינויים בצפיפות כלי הדם המיקרוסקופיים, הוא לרוב תלוי מינון וזמן באופן מובהק בהשוואה לאנגיוגנזה המתווכת על ידי VEGF או basic FGF במינונים פיזיולוגיים בקירוב. אנגיוגנזה המתווכת על ידי תאי מאסט, MCMA, המושרה באמצעות הפעלה סלקטיבית של תאי מאסט in situ, מאופיינת בעוצמה גבוההconsiderably ובמשך זמן ארוך להפליא. למעשה, אנגיוגנזה המתווכת על ידי תאי מאסט תוארה לראשונה באמצעות בדיקה זו בשל היכולת לכמת משתני אנגיוגנזה אובייקטיביים, רמת הרלוונטיות הביולוגית הגבוהה של המערכת והאפשרות לבדוק רעילות של הטיפול.המתודולוגיה מתאימה באופן ייחודי לניתוחים של קשר מבנה-פעילות ותגובה למינון. מודל ה-MWAA בחולדה מהווה מודל לחקר אנגיוגנזה ברקמה ויסקרלית מבוגרת בעלת וסקולריזציה טבעית, שבה אין אנגיוגנזה פיזיולוגית והיא אינה מושפעת מהניתוח, ובכך נמנית כל השפעה של אנגיוגנזה המושרה על ידי ריפוי פצעים. הבדיקה היא כמותית באמת ומעריכה במדויק מספר משתנים אובייקטיביים בעלי רלוונטיות ביולוגית המתארים את ההתרחבות המרחבית, הצפיפות ותבנייות היווצרות של מיקרו-כלי דם.הבדיקה מתאימה מאוד לחקר ההשפעות הסיסטמיות של אנגיוגנזה, גורמים מווסתים, ולמחקרים של מבנה-פעילות ותגובה למנה. המתודולוגיה המתוארת כאן פותחה במעבדתו של ד"ר Kloss Carl Norby במחלקה לפתולוגיה, בית החולים האוניברסיטאי Reka, jute Borg באוניברסיטת Gothenburg שבשוודיה. מועצת המחקר הרפואי השוודית, מספר פרויקט 5 9 4 2, תמכה בכל המחקרים בפרויקט זה.הסיוע הטכני המיומן של גברת Gun Effer, שהייתה מעורבת מאז תחילת הפרויקט, של גברת Monica Anderson (שאינה נוכחת) ושל גברת Ann Nemar Lindgren מוכר בהערכה.אני מקווה שמצגת קצרה זו העניקה לכם מושג לגבי הפוטנציאל של הבדיקה. אם תשתמשו בבדיקה זו במעבדה שלכם, אשמח לסייע לכם אם תיתקלו בבעיה טכנית כלשהי. כמו כן, אודה מאוד לכל הצעה שתהיה לכם.תודה.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרט מוצג במודל כדי לחקור את הפיתוח של היפרפלזיה intimal לאחר הפריסה סטנט באמצעות הכלי האנושי (הר"י) במודל עכברים immunodeficient.

האדם הפנימי החלב (הר&quot;י) עורק השתלת סטנט: דגם האדם ללמוד פיתוח restenosis ב-סטנט

מאמר זה מתאר מודל פשוט של גירוי אנגיוגנזה ב לפדר את העכברוש. המודל מייצר עליות דרמטיות באזור נימי, מצמיח כלי דם וצפיפות כלי הדם במשך זמן קצר יחסית ברקמות המאפשר en להדמיה פני רשתות שלמות כלי הדם עד לרמה תא בודד.

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

טכניקת לנדיס המותאמת מאפשרת מדידה זוגית של המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלים בודדים במזנטריה של חולדות רגילות וחולדות מהונדסות גנטית בתנאי בקרה ובדיקה באמצעות טכניקות מיקרו-פרפוזיה. הוא מספק שיטה נוחה להערכת מנגנונים המווסתים את חדירות המיקרו-כלי דם וחילופי כלי דם בתנאים פיזיולוגיים.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

כתב יד זה מתאר בדיקת היווצרות צינור כדי לכמת את ההשפעות של תרכובת או מצב נתון על אנגיוגנזה על ידי שימוש בהיווצרות צינור תא אנדותל בסביבה מבוקרת.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

אנגיוגנזה כוללת אינטראקציות רב-תאיות ורב-מערכתיות שיש לחקור בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. מטרת מחקר זה היא להדגים את יכולתו של מודל תרבית המזנטריה של חולדות לבצע השוואות זמן-lapse של רשתות מיקרו-וסקולריות שלמות במהלך אנגיוגנזה.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

כאן, אנו מציגים שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים איפה תרבותי משותף עם אבי העורקים, נגזר רשתות אנדותל עכברוש תאים mesenchymal prelabelled. שיטה חדשנית זו מאפשרת הדמיה של תאי סטרומה Mesenchymal (MSCs) יונת ושילוב עם רשתות אנדותל, כימות של מאפייני רשת, והערכה של הביטוי immunophenotypes וג'ין MSC.

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

אנו מתארים שתי שיטות להערכת חדירות בכלי הדם ארעי הקשורים עם מיקרוסביבה הגידול של גרורות (tmem) הדלת הפתח ואת התא סרטן in, באמצעות הזרקה ורידית של משקל גבוה-מולקולרי (155 kda) תוספי בעכברים. השיטות כוללות הדמיה של האינטרטל בבעלי חיים חיים וניתוח רקמות קבועות באמצעות מאימונולובורנציה.

הערכת מיקרוסביבה הגידול של גרורה בתיווך החדירות כלי דם הקשורים להפצת תאים סרטניים באמצעות הדמיה Intravital וניתוח רקמות קבוע

כאן, אנו מראים פוטנציאל טיפולי של אנטי-אנגיוגנטי הקשורים לגידול נויטרופילים לאחר העברתו לתוך עכברים נושאת הגידול. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לתמרן את פעילות נויטרופילים לשעבר vivo וכתוצאה מכך להעריך את הפונקציונליות שלהם ב vivo בפיתוח גידולים. זהו מודל מתאים ללימודי חיסוני פוטנציאלי מבוססי נויטרופילים.

העברה של הגידול מניפולציות הקשורים נויטרופילים לתוך הגידול עכברים נושאת ללמוד פוטנציאל אנגיוגנטי שלהם ב Vivo

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר התאוששות של מבנים דמויי צינור שנוצרו במבחן היווצרות צינור אנגיוגנזה קלאסי במבחנה שבו תאים, כגון תאי טרופובלסט, מתארגנים במבנים דמויי נימים על גבי שכבה של מטריצת קרום בסיס חוץ-תאית. המבנים המשוחזרים משמשים לבידוד RNA וחלבונים לניתוחים ביוכימיים שונים.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

חקור אנגיוגנזה דה נובו ברקמת ממברנה ויסרלית של עכברושים בוגרים באמצעות מודל חלונות המזנטריום. שיטה זו מאפשרת מדידות כמותיות של צפיפות כלי דם ודפוסי התפשטות לחקר מחלות סרטן.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

גלה סרטונים נוספים