אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

שלום, אני Victor Chi, סטודנט לתואר מתקדם במעבדת Chandy במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה, אירביין. היום אני הדגים כיצד לצבוע סדרה של חתכים טבועים בפראפין באמצעות ערכת A b, C מבית Vector Laboratories. הליך זה כולל הסרת שעווה והידרציה של חתכים טבועים בפראפין, ביצוע שחזור אנטיגנים בהשראת חום כדי לחשוף אנטיגנים, חסימת פראוקסידאז וקישור לא ספציפי של חלבונים, אינקובציה עם CD four ו-tyrosine hydroxylase ונוגדנים משניים, ופיתוח והרכבה של הפלייד.

נתחיל בתהליך. מכיוון שהסליידים מקודדים בפרפין, השלב הראשון הוא הסרת השעווה מהסליידים. פעולה זו מבוצעת בדרך כלל במכסה מסיכה (fume hood) באמצעות שלושה צנצנות של xylene, כאשר כל שטיפה נמשכת חמש דקות, ובסך הכל מבוצעים שלושה סבבי שטיפה.

לאחר מכן, העבירו את השקופיות לתוך אתנול בריכוז של 100%. תבחינו כי השעווה על השקופיות נעלמה, אך היזהרו שלא לגעת בשקופיות עם כפפות, כיוון שהקסילן ימיס את הגומי של הכפפות. משם, העבירו את השקופיות, כשהן עדיין באתנול בריכוז של 100%, חזרה למעבדה, שם הן יעברו גרדיאנט הידרציה.

כעת אדבר על מדרג ההידרציה שבו נעביר את השקופיות. התהליך מתחיל בשני אמבטיות של 100% ethanol. משם, נעביר את השקופיות לשתי אמבטיות המכילות 95% ethanol.

לאחר מכן נעביר את השקופיות לאמבטיה של 70% ethanol, ומשם נעביר אותן לאמבטיה של 50% ethanol. לאחר מכן, נעביר את השקופיות ל-30% ethanol, ושתי דקות לאחר מכן נעביר אותן למים מזוקקים כפולים. לאחר הטיפול במים מזוקקים כפולים, נשאיר את השקופית ב-PBS.

כעת אדגים לכם כיצד להעביר את השקופיות מאמבט אחד למשנהו באמצעות נשאי השקופיות. השלב הראשון הוא להוציא את השקופיות בעזרת מחזיק הנשאיים ולגרד אותן בעדינות כדי להסיר עודפי נוזל, כך שלא תעבירו כמות גדולה מדי של נוזל לאמבט הבא. לאחר מכן, טבלו אותן פנימה והמתינו שתי דקות עד לשינוי המדרגה הבא.

במקרים רבים כאשר הרקמות מקובעות, האנטיגן הופך למסוות כך שהנוגדן אינו יכול להיקשר אליו. לכן, כעת אראה לכם שיטה לשחזור אנטיגן מושרה בחום באמצעות נתרן ציטרט. כעת אנו נמצאים ליד המיקרוגל, שבו אסיר את המסוואות מהאנטיגן CD8, שאותו אנסה לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

כעת אני אמסוך את התמיסה ואחמם אותה במיקרוגל למשך 15 דקות. נרתיח את ה-sodium citrate יחד עם השקופיות למשך 15 דקות כדי להבטיח שהשקופיות לא יתייבשו. נפקח על השקופיות, ובמקרה של גלישה של הנוזל בעקבות הרתיחה, נמלא שוב sodium citrate כדי להבטיח שהשקופיות יישארו הידרטניות.

לפני שאני מכניס את השקופיות לנתרן ציטראט, אני מחמם מראש את התמיסה למשך 45 שניות. לאחר מכן, אני מכניס את השקופיות לנתרן הציטראט ומחמם אותו למשך 15 דקות. כאשר השקופיות בפנים, התמיסה תתחיל בדרך כלל לרתוח ולהישפך החוצה לאחר כשתי עד שתיים וחצי דקות מתחילת תהליך הרתיחה.

בשלב זה, אעצור ואחליף את הנתרן ציטראט שאיבד את יעילותו בנתרן ציטראט טרי. לאחר הרתחת הנתרן ציטראט במשך 15 דקות, עלינו להוציא את השקופיות והתמיסה ולקרר אותם. הדרך הטובה ביותר לעשות זאת היא לסגור את מחזיק השקופיות, לשפוך את עודפי הנוזל, ולהזרים עליו זרם של מים קרים עד שהתמיסה בתוך הצנצנת תתקרר לטמפרטורת החדר.

פעולה זו אורכת בדרך כלל כ-10 עד 15 דקות. לאחר הוצאת השקופיות מהכיור, עלינו לחסום את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית ברקמות. לשם כך, נכין תמיסת מי חמצן, תוך שימוש במי חמצן בריכוז 30% כדי להכין תמיסת מי חמצן בריכוז 1%.

ומכאן, אני פשוט מעבירה את השקופיות ישירות לתוך תמיסת מימן פéroקסיד. כעת נדגיר את השקופיות במימן פéroקסיד למשך 20 דקות. כעת, לאחר שחלפו 20 דקות, ואחרי חסימת הפרוקסידאז האנדוגנית, אשטוף את מימן הפéroקסיד מהשקופיות באמצעות שטיפות של PBS.

כעת אעביר את השקופיות למנשא ואשטוף אותן בשלוש שטיפות של חמש דקות כל אחת. השקופיות הונחו גב אל גב כדי למנוע מגע עם שקופיות אחרות שעלול לפגוע ברקמה. לכן, אני פשוט מחליק את השקופיות ומסדר אותן כך שלא תהיה לרקמה אפשרות לבוא במגע עם הזכוכית.

כעת נעביר את השקופיות ל-PBS. לאחר שטיפת השקופיות ב-PBS, אבצע חסימה של השקופיות למניעת קישור לא ספציפי של חלבונים באמצעות תמיסה של 5% BSA, 5% goat serum ו-0.1% sodium azide. יש להחליף את ה-goat serum במין אחר אם אתם עובדים עם נוגדנים מעזים.

כעת, אני פשוט אכניס את השקופיות למחזיק השקופיות ואמלא אותו בתמיסה שלנו. בדרך כלל אני ממלא אותו עד למחצית, כך שנפח השקופיות יבטיח שהרקמות יהיינו טבולות. דבר אחד שחשוב לוודא בעת הכנסת השקופיות למכל הוא למנוע מרקמות אלו לגעת בדפנות המכל.

עבור השקופית האחרונה, סובבו אותה פנימה כך שהרקמה לא תיגע במכל. כעת, לאחר שביצעתי חסימה לשקופיות למשך הלילה, אשטוף את תמיסת החסימה העודפת בשלוש שטיפות, כאשר כל אחת נמשכת חמש דקות ב-PBS. בשלב זה, נרצה לצייר עיגול באמצעות חסם נוזלי מסביב לרקמה שלנו, כדי למזער את כמות הנוגדן שבה נשתמש.

אם אינכם חוששים מצריכת הנוגדנים, תוכלו תמיד לדגור את השקופיות באותן נסניות שבהן ביצענו את שלב החסימה. מהשלב הזה והלאה, אראה לכם כיצד אנו משרטטים עם חומר חסימה נוזלי מסביב לרקמה שלנו. ראשית, נסיר את שארית הנוזל העודף, בזהירות שלא לגעת ברקמה.

כעת פשוט נגבו את הפינות כדי להסיר נוזלים עודפים. שוב, היו זהירים מאוד מאוד שלא לגעת ברקמה. קחו את פין שחרור החסימה של הנוזל, לחצו למטה בעדינות כדי להפעיל את הזרימה, ומשם, הקיפו את הרקמה בעזרת העט שלכם.

המתינו לייבוש החסם הנוזלי למשך כ-15 שניות. בשלב זה, עלינו להוסיף את הנוגדן הראשוני. השתמשו בפיפטה כדי לוודא כי הרקמה מכוסה בנוגדן הראשוני, והעבירו אותה לקופסה הבקרה ללחות.

לכן נשתמש בנייר Kim wipe. נרטיב אותו במעט di water בתוך הקופסה כדי למנוע מהסרטית להתייבש בזמן הדגרה עם הנוגדן הראשוני. כעת, לאחר שהנוגדן הראשוני הודגר במשך שעה, נוציא את הסריטות ונשטוף את עודפי הנוגדן באמצעות PBS.

שוב, פשוט אפשרו לנוזל להתנקז והכניסו את הדגימה לשטיפת PBS. ושוב, שטפו שלוש פעמים למשך חמש דקות. לאחר שלושת השטיפות של חמש דקות, נוסיף את הנוגדן המשני לרקמה באותו האופן שבו הוספנו את הנוגדן הראשוני.

השתמשו בנפח מספיק כדי לכסות את הרקמות, הוסיפו את הנוגדן המשני, ובמקרה זה אנו משתמשים ב-goat anti rabbit, והחזירו את השקופית לתא הבקרה של הלחות. אנו משתמשים בנוגדן משני, שהוא biotinylated goat anti rabbit, דבר שחיוני כאשר משתמשים בשיטת ה-ABC. העבירו את השקופית לתא הבקרה של הלחות והניחו לה להדגיר למשך שעה אחת.

בזמן שנוגדן המשני עובר אינקובציה, עלינו להכין את ריאגנט ה-ABC. אנו משתמשים בריאגנט A, B, C של Vector Laboratories מתוך ערכת Vector Stain. הוציאו את ריאגנט a, בצעו לו פרימינג (prime), וטיפטפו שלוש פעמים לתוך 15 milliliters של PBS, תוך הקפדה לא ללחוץ על השפופרת מכיוון שהטיפות חייבות להיות במינון מדויק ובגודל ספציפי.

לאחר שהנוגדן המשני עבר דגירה במשך כשעה, קחו את השקופיות ושטפו אותן שוב ב-PBS, בדיוק כפי שעשיתם עם הנוגדן הראשוני. לאחר שלושה שלבי שטיפה של חמש דקות כל אחד, העבירו את השקופיות למכל זה, שבו תוסיפו את ריאגנט ה-A B, C, שהכנתים 30 עד 45 דקות מראש. הוסיפו את ריאגנט ה-A, B, C למכל, מלאו את השקופיות והניחו להן לעבור דגירה למשך 30 עד 45 דקות נוספות.

לאחר שהשקופיות שהו ב-A, B, C במשך כ-3 עד 5 דקות, עלינו לשטוף את עודפי תמיסת A, B, C. לשם כך, הוציאו את השקופיות והעבירו אותן לתמיסת PBS. יש לחזור על הליך השטיפה זה שלוש פעמים ב-PBS, למשך חמש דקות בכל שטיפה.

בזמן ששטיפת הנסכים מתבצעת, אני מכין את תת-המצע DAB peroxidase מבית Vector Laboratories. אני לוקח את הבאפר pH 7.5 ומוסיף שתי טיפות ממנו. לאחר הבאפר pH 7.5, אני לוקח את ריאגנט תת-המצע DAB ומוסיף שתי טיפות ממנו.

שוב, גודל הטיפה הוא קריטי, לכן אין לסחוט את הבקבוק ויש פשוט לאפשר לטיפות לנפול. שתי טיפות עבור באפר pH 7.5. לאחר מכן, יש להוסיף ארבע טיפות של ריאגנט substrate DAB, תוך מתן אפשרות לטיפות לנפול באופן טבעי.

בסיום יש להוסיף שתי טיפות של ריאגנט התשתית מימן פרוקסיד. כך צריכה להיראות תערובת ריאגנט התשתית של ה-DAB. כעת התערובת מוכנה להוספה ללמיות; הוציאו את הלמיות ואפשרו ל-PBS פשוט להתנקז מהן.

עם הזמן, ריאגנט ה-DAB הופך לחום יותר. לכן, ברצוננו להוסיף אותו לזהליות בשלב זה. קחו נפח מספיק כדי לכסות את הרקמות והוסיפו אותו ישירות על דגימות הרקמה.

כעת קחו את הנפח המתאים והוסיפו אותו ישירות על דגימות הרקמה, והמתינו להתפתחות התמיסה; דגימות הרקמה אמורות להפוך לחומות יותר עם הזמן. לאחר הוספת תמיסת ה-DAB, ניתן לראות בחתך מוחי זה שבהם הרקמה הופכת לחומה כאן וכאן. הצביעה החומה של ה-DAB חושפת את האזור המכיל נוירונים דופמינרגים של המוח האמצעי.

לאחר פיתוח השקופיות למשך זמן שבין שתי ל-10 דקות, יש להעבירן למים קרים עם קרח כדי לעצור את התגובה. פשוט הרשוא לתרסיס להתנקז והעבר את השקופיות ישירות למים הקרים עם הקרח. לאחר טבילת השקופיות במים הקרים עם הקרח, העבר את אמבט הצביעה לכיור והזרם לתוכה מים קרים למשך כחמש דקות, כדי להבטיח שכל תמיסת ה-DAB נוקזה מהאמבט.

לכן, כאשר אתם מוסיפים את הדגימות לכיור, היזהרו שזרם המים לא יפגע ברקמה, אלא יפגע באחת הפינות ויגרום למים פשוט להישפך, כדי שהרקמות לא יסבלו מהפרעה כתוצאה מזרימת המים. לאחר הוצאת השקופיות מהשטיפה, עליכם לבצע צביעה נגדית. מדוע עשוי להיות צורך בצביעה נגדית?

ובכן, סיבה אחת היא שייתכן שתרצו לראות את מבנה הרקמה שלכם. סיבה נוספת היא כדי להמחיש את כל התאים. לכן, למטרותינו, נבצע צביעה נגדית ב-hematoxylin, המשמש לצביעת הגרעינים.

כעת עלינו לקחת את השקופיות, להסיר עודפי נוזלים, ולטבול אותן פעם אחת בתמיסת Hemat Hematin. לאחר מכן, יש להוציא אותן ולהעבירן ישירות למים. לאחר הוספת השקופיות למי ברז, יש להחזיק את השקופיות תחת זרם מים, בדיוק כפי שנעשה קודם לכן עם אמבט מי הקרח.

עבור שטיפת ההמטוקסילין, פשוט הניחו למים לזרום לתוך הצנצנת עד שהמים בתוכה יהפכו שקופים. לאחר הוצאת השקופיות שצבעו בצבע נגדי מהמים, נרצה לבצע דהידרטציה מחדש של השקופיות. לכן, נעביר אותן שוב דרך סדרת הדילול של האתנול, אך בסדר הפוך.

בצעו שטיפה אחת במים דה-יוניים, שטיפה אחת ב-30% ethanol, שטיפה אחת ב-50% ethanol, שטיפה אחת ב-70% ethanol, שתי שטיפות ב-95% ethanol ושתי שטיפות ב-100% ethanol, כאשר כל שלב נמשך שתי דקות. הוציאו את השקופיות, נגבו את עודפי הנוזלים והעבירו אותן ישירות ל-30% ethanol, והמתינו שתי דקות. לאחר שטיפת ה-100% ethanol האחרונה, החזירו את השקופיות לתוך ה-xylene.

כעת קחו שוב את השקופיות, גרדו את עודפי הנוזל, והכניסו את השקופיות לקסילן הראשון למשך חמש דקות. אלו יהיו שלושה שטיפות רצופות בקסילן למשך חמש דקות כל אחת. כעת אנו מוכנים להרכיב את השקופיות.

לכן, מה שאני עושה בדרך כלל הוא דקה לפני שהשקופיות מוכנות, אני לוקח את הפסטור-פיפט שלי ושואב את תמיסת הקיבוע (perm mount), וממתין כדקה עד שהשקופיות מוכנות להוצאה. לאחר השטיפה האחרונה ב-xylene, תוך הקפדה לא להטביל את הכפפות או להרטיבן ב-xylene, הוצאו אותן בעזרת פינצטה, תוך תשומת לב לאיזה צד פונה הרקמה. נגבו בעדינות את שאריות ה-xylene בעזרת נייר Kimwipe, תוך הקפדה לא לגעת ברקמה; נגבו בזהירות רק את הפינות והקצוות, ואפשרו למרבית ה-xylene להתאדות. ניתן לעבוד ככל הנראה על שתי שקופיות לפני שאחת מהן מתייבשת.

כאשר תסיימו לייבש שקף אחד, השקף השני אמור להיות מוכן לעבודה. כעת עליכם לעבוד איתם לפני שהם מתייבשים לחלוטין. לכן, עליכם לקחת את ה-perimount ולשרטט קו דק לצד הרקמה, תוך הקפדה לא לגעת ברקמה.

הסירה את ה-perimount יחד עם זכוכית המכסה. הנח אותה בזווית של 45 מעלות ואפשר לה להנמיך. לאחר מכן, גחור את זכוכית המכסה, תוך וידוא שה-perimount מכסה את כל הרקמות.

לאחר מכן, הניחו את הזכוכית ולחצו בעדינות במרכז כדי להוציא את כל בועות האוויר העודפות. אפשרו לזה להתייבש בזמן העבודה על רקמה שנייה; זה אינו הזמן לבחון את השקופיות. עלינו לאפשר ל-perma mount להתייבש למשך הלילה לפני בחינת השקופיות.

בניגוד לכך, תחת תאורת המיקרוסקופ, ה-perma mount יפתח בועות, ובכך תהרסו את הדגימה שלכם. להלן מבט על חתיכות המוח שלנו לאחר צביעה בחומרים כימיים, נוגדן פוליקלונלי של ארנב המכוון נגד tyrosine hydroxylase. שוב, צביעת ה-DAB החומית מראה את מיקומם של נוירונים דופמינרגיים בג้าน המוח.

צביעת הנגד של ההמטין הופכת את כל הגרעינים ברקמה זו לכחולים. כך הראיתי לכם כיצד לצבוע חתכים טבועים בפראפין באמצעות ערכת ה-ABC מ-Vector Laboratories. כעת תרצו להתאים את התנאים בהתאם לסוגי הרקמות שתצבעו ולאנטיגנים שתשתמשו בהם.

בהצלחה בניסויים שלכם.