Name: אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 38 s
Description: למדו אימונוהיסטוכימיה בחתכי פרפין באמצעות ערכת ABC Vectastain מ-Vector Labs. הפרוטוקול כולל פתיחת אנטיגנים באמצעות חימום, חסימת פרוקסידזה ודגימת נוגדנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מכתים סעיפים פרפין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax שקופיות עם קסילן (פישר X3 S -4) 3x 5 דקות כל אחד (קסילן לשנות מדי חודש בהתאם לשימוש, קסילן הוא רעיל). השתמש מנות מכסה במשך 20 שקופיות פישר נ&quot;צ 08-812-1A ו racks עשה כדי להתאים את הכלים האלה. 200 מ&quot;ל נוזלים לכל מאכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה דרך שיפוע אלכוהול כדלקמן (שינוי הדרגתי כל 2 שבועות): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x באתנול 100% (פישר # A406-20) עבור כל 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x באתנול 95% עבור כל 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x באתנול 70% עבור 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x באתנול 50% עבור 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x באתנול 30% עבור 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x DDH 2 O 2 דקות </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים DPBS דקות 5 (DPBS = פוספט שונה של Dulbecco בופר עם Ca 2 + ו - Mg 2 +). </li></ol> Antigen התאוששות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את מאגר Na-ציטראט (10 מ&quot;מ, ה-pH 6.5) במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבשלים את השקופיות עבור 15 דקות במיקרוגל. השקופיות לא צריך לבדוק כל כך יבש דקות ולהוסיף Na-ציטראט בעת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו מגניב בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת פעילות peroxidase אנדוגני עם 1% H 2 O 2 ב DPBS במשך 20 דקות (1.5 מ&quot;ל של המניה 30% סיגמא H-1009 ב DPBS 50 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים 5 דקות DPBS 3 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הלא ספציפית באתרים דוגרים על ידי לילה ב 4 מעלות צלזיוס DPBS + 5% שור בסרום אלבומין (BSA) + 0.1% אזיד Na + 5% בסרום. הערה: בחירת נסיוב יהיה תלוי מין שבו נוגדנים המשמשים מכתים נעשו. בלוק עם סרום מן המינים שבו אב משני (מצומדות כדי ביוטין) התקבלה. אם זה אינו זמין, להשתמש בסרום של זן שונה מזה שבו Ab העיקרית נעשתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת האתרים ביוטין עם avidin / ביוטין חסימת Kit (וקטור מעבדות קטלוג # SP-2001): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם Avidin D במשך 15 דקות. לשטוף קצר עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון ביוטין במשך 15 דקות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים את Ab העיקרי 2 שעות בטמפרטורת החדר, ב DPBS + 2% + BSA NaAzide 0.1% + 2% בסרום (זהה עבור חסימת צעד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים 5 דקות PBS 3 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם Ab המשני מצומדות עם ביוטין שעה 1 בטמפרטורת החדר DPBS + 2% + 0.1% BSA Na אזיד + 2% בסרום (כמו משמש צעד חסימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגיב ABC באותו זמן כי יש לפתח דקות לפחות 30 לפני השימוש! (ראה חומרים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. בשנת 15 DPBS מ&quot;ל (ללא נסיוב, לא אזיד) להוסיף 3 טיפות של מגיב, לערבב ולהוסיף 3 טיפות של B מגיב ומערבבים. הימנע לסחוט את הבקבוקים, אלא לחכות טיפות כדי ליצור בכוחות עצמם. ABC ערכת Vectastain PK-6100 מ-Vector Labs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים 5 דקות DPBS 3 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם מגיב ABC עבור 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים 5 דקות DPBS 3 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת המצע DAB peroxidase (וקטור Labs # SK-4100) ב 5 מ&quot;ל DDH 2 O בבקבוקון זכוכית מיד לפני השימוש (ראה חומרים) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 טיפות של תמיסת למלאי, לערבב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 טיפות של DAB, לערבב (צריך להיות מעט חום) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 טיפות H 2 O 2, לערבב </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק את המצע DAB על גבי שקופיות ולצפות עבור כתמים חומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות לקרח + ברז כדי לעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף תחת מי ברז קרים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם Hematoxylin (20 שניות; פישר CS401-D) ולשטוף במי ברז עד שהמים מגיע ברורה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים דרך שיפוע אלכוהול החל אתנול 30% עד 100% אתנול (2 דק &#39;כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים קסילן דקות 3 x 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר עם Permount (פישר # SP15-100): לשים כמה לעיל בסעיף בשקופית ולחץ לאט על הקטע עם coverslip ללא בועות אוויר. אל תזיז את coverslip עד יבש לחלוטין, אשר לוקח ~ 24 שעות. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>קסילן</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>יש להחליף את ה-xylene בכל חודש, בהתאם למידת השימוש. xylene הוא רעיל.</td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>השתמש להכנת מדרג אתנול (EtOH).</td></tr><tr><td>DPBS</td><td></td><td></td><td>דולבקו&amp;rsquo;סלקוציה של Phosphate Buffered Saline משופר עם Ca2+ ו-Mg2+</td></tr><tr><td>בופר Na-Citrate</td><td></td><td></td><td>10 mM, pH 6.5</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1009</td><td>תמיסת מקור (stock) בריכוז 30% =&amp;gt; דלל ל-1% ב-DPBS</td></tr><tr><td>תמיסת חסימה</td><td></td><td></td><td>DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% סרום. </td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td></td><td></td><td>סודיום אזיד</td></tr><tr><td>ערכה לחסימת אווידין/ביוטין</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>בופר נוגדנים (Ab buffer)</td><td></td><td></td><td>DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% סרום (בדומה לזה ששימש לשלב החסימה)</td></tr><tr><td>ערכה ABC Vectastain PK-6100</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סובסטרט פרוקסידאז DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים כפולים (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-D</td><td>צביעה נגדית</td></tr><tr><td>סגירה (Permount)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות עצמים וזכוכיות כיסוי</td><td></td><td></td><td>זכוכית</td></tr></tbody></table>

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש abc vectastain קיט מ וקטור labs

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה יקר מנוצל כדי למקם / לדמיין ביטוי חלבון בסעיף רקמה רכוב באמצעות נוגדנים ספציפיים. קיימות שתי שיטות: השיטה הישירה והעקיפה. בניסוי זה, נוכל רק לתאר את השימוש מכתים IHC עקיף. העקיפים מכתים IHC מנצל מאוד ספציפיות נוגדנים משני הראשי ביוטין, מצומדות. נוגדנים ראשי מנוצלים discretely לזהות חלבונים עניין באמצעות קשירה epitope מסוים, ואילו נוגדנים משני לחסר עבור מכתים הלא ספציפית רקע להגביר את האות על ידי יצירת קומפלקסים כדי נוגדן הראשוני. שקופיות יכול להיות שנוצר חלקים קפואים, או חלקים פרפין מוטבע רכוב על שקופיות הזכוכית. בפרוטוקול זה, אנו דנים על הכנת פרפין משובצים קטעים ידי הידרציה dewaxing, באמצעות שיפוע אלכוהול, אחזור המושרה חום אנטיגן, וחסימת פעילות peroxidase אנדוגני ולא אתרי קישור ספציפיים. סעיפים חלקם מוכתמים אז עם נוגדנים ספציפיים עבור סמן תא T CD8 ו בעוד אחרים הם מוכתם עבור hydroxylase טירוזין. מגלשות מטופלים לאחר מכן עם נוגדנים משני המתאים מצומדות כדי ביוטין, שפותחה לאחר מכן ניצול avidin-מצומדות peroxidase חזרת (HRP) עם Diaminiobenzidine (DAB), כמו המצע. בעקבות פיתוח, מגלשות הם counterstained עבור לעומת זאת, ועלה תחת coverslips עם permount. לאחר ייבוש נאותה, מגלשות אלה אז מוכן הדמיה.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה בעלת ערך המשמשת לאיתור/ויזואליזציה של ביטוי חלבונים בתוך נתח רקמה מקובע באמצעות...

שלום, אני Victor Chi, סטודנט לתואר מתקדם במעבדת Chandy במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה, אירביין. היום אני הדגים כיצד לצבוע סדרה של חתכים טבועים בפראפין באמצעות ערכת A b, C מבית Vector Laboratories. הליך זה כולל הסרת שעווה והידרציה של חתכים טבועים בפראפין, ביצוע שחזור אנטיגנים בהשראת חום כדי לחשוף אנטיגנים, חסימת פראוקסידאז וקישור לא ספציפי של חלבונים, אינקובציה עם CD four ו-tyrosine hydroxylase ונוגדנים משניים, ופיתוח והרכבה של הפלייד.נתחיל בתהליך. מכיוון שהסליידים מקודדים בפרפין, השלב הראשון הוא הסרת השעווה מהסליידים. פעולה זו מבוצעת בדרך כלל במכסה מסיכה (fume hood) באמצעות שלושה צנצנות של xylene, כאשר כל שטיפה נמשכת חמש דקות, ובסך הכל מבוצעים שלושה סבבי שטיפה.לאחר מכן, העבירו את השקופיות לתוך אתנול בריכוז של 100%. תבחינו כי השעווה על השקופיות נעלמה, אך היזהרו שלא לגעת בשקופיות עם כפפות, כיוון שהקסילן ימיס את הגומי של הכפפות. משם, העבירו את השקופיות, כשהן עדיין באתנול בריכוז של 100%, חזרה למעבדה, שם הן יעברו גרדיאנט הידרציה.כעת אדבר על מדרג ההידרציה שבו נעביר את השקופיות. התהליך מתחיל בשני אמבטיות של 100% ethanol. משם, נעביר את השקופיות לשתי אמבטיות המכילות 95% ethanol.לאחר מכן נעביר את השקופיות לאמבטיה של 70% ethanol, ומשם נעביר אותן לאמבטיה של 50% ethanol. לאחר מכן, נעביר את השקופיות ל-30% ethanol, ושתי דקות לאחר מכן נעביר אותן למים מזוקקים כפולים. לאחר הטיפול במים מזוקקים כפולים, נשאיר את השקופית ב-PBS.כעת אדגים לכם כיצד להעביר את השקופיות מאמבט אחד למשנהו באמצעות נשאי השקופיות. השלב הראשון הוא להוציא את השקופיות בעזרת מחזיק הנשאיים ולגרד אותן בעדינות כדי להסיר עודפי נוזל, כך שלא תעבירו כמות גדולה מדי של נוזל לאמבט הבא. לאחר מכן, טבלו אותן פנימה והמתינו שתי דקות עד לשינוי המדרגה הבא.במקרים רבים כאשר הרקמות מקובעות, האנטיגן הופך למסוות כך שהנוגדן אינו יכול להיקשר אליו. לכן, כעת אראה לכם שיטה לשחזור אנטיגן מושרה בחום באמצעות נתרן ציטרט. כעת אנו נמצאים ליד המיקרוגל, שבו אסיר את המסוואות מהאנטיגן CD8, שאותו אנסה לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה.כעת אני אמסוך את התמיסה ואחמם אותה במיקרוגל למשך 15 דקות. נרתיח את ה-sodium citrate יחד עם השקופיות למשך 15 דקות כדי להבטיח שהשקופיות לא יתייבשו. נפקח על השקופיות, ובמקרה של גלישה של הנוזל בעקבות הרתיחה, נמלא שוב sodium citrate כדי להבטיח שהשקופיות יישארו הידרטניות.לפני שאני מכניס את השקופיות לנתרן ציטראט, אני מחמם מראש את התמיסה למשך 45 שניות. לאחר מכן, אני מכניס את השקופיות לנתרן הציטראט ומחמם אותו למשך 15 דקות. כאשר השקופיות בפנים, התמיסה תתחיל בדרך כלל לרתוח ולהישפך החוצה לאחר כשתי עד שתיים וחצי דקות מתחילת תהליך הרתיחה.בשלב זה, אעצור ואחליף את הנתרן ציטראט שאיבד את יעילותו בנתרן ציטראט טרי. לאחר הרתחת הנתרן ציטראט במשך 15 דקות, עלינו להוציא את השקופיות והתמיסה ולקרר אותם. הדרך הטובה ביותר לעשות זאת היא לסגור את מחזיק השקופיות, לשפוך את עודפי הנוזל, ולהזרים עליו זרם של מים קרים עד שהתמיסה בתוך הצנצנת תתקרר לטמפרטורת החדר.פעולה זו אורכת בדרך כלל כ-10 עד 15 דקות. לאחר הוצאת השקופיות מהכיור, עלינו לחסום את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית ברקמות. לשם כך, נכין תמיסת מי חמצן, תוך שימוש במי חמצן בריכוז 30% כדי להכין תמיסת מי חמצן בריכוז 1%.ומכאן, אני פשוט מעבירה את השקופיות ישירות לתוך תמיסת מימן פéroקסיד. כעת נדגיר את השקופיות במימן פéroקסיד למשך 20 דקות. כעת, לאחר שחלפו 20 דקות, ואחרי חסימת הפרוקסידאז האנדוגנית, אשטוף את מימן הפéroקסיד מהשקופיות באמצעות שטיפות של PBS.כעת אעביר את השקופיות למנשא ואשטוף אותן בשלוש שטיפות של חמש דקות כל אחת. השקופיות הונחו גב אל גב כדי למנוע מגע עם שקופיות אחרות שעלול לפגוע ברקמה. לכן, אני פשוט מחליק את השקופיות ומסדר אותן כך שלא תהיה לרקמה אפשרות לבוא במגע עם הזכוכית.כעת נעביר את השקופיות ל-PBS. לאחר שטיפת השקופיות ב-PBS, אבצע חסימה של השקופיות למניעת קישור לא ספציפי של חלבונים באמצעות תמיסה של 5% BSA, 5% goat serum ו-0.1% sodium azide. יש להחליף את ה-goat serum במין אחר אם אתם עובדים עם נוגדנים מעזים.כעת, אני פשוט אכניס את השקופיות למחזיק השקופיות ואמלא אותו בתמיסה שלנו. בדרך כלל אני ממלא אותו עד למחצית, כך שנפח השקופיות יבטיח שהרקמות יהיינו טבולות. דבר אחד שחשוב לוודא בעת הכנסת השקופיות למכל הוא למנוע מרקמות אלו לגעת בדפנות המכל.עבור השקופית האחרונה, סובבו אותה פנימה כך שהרקמה לא תיגע במכל. כעת, לאחר שביצעתי חסימה לשקופיות למשך הלילה, אשטוף את תמיסת החסימה העודפת בשלוש שטיפות, כאשר כל אחת נמשכת חמש דקות ב-PBS. בשלב זה, נרצה לצייר עיגול באמצעות חסם נוזלי מסביב לרקמה שלנו, כדי למזער את כמות הנוגדן שבה נשתמש.אם אינכם חוששים מצריכת הנוגדנים, תוכלו תמיד לדגור את השקופיות באותן נסניות שבהן ביצענו את שלב החסימה. מהשלב הזה והלאה, אראה לכם כיצד אנו משרטטים עם חומר חסימה נוזלי מסביב לרקמה שלנו. ראשית, נסיר את שארית הנוזל העודף, בזהירות שלא לגעת ברקמה.כעת פשוט נגבו את הפינות כדי להסיר נוזלים עודפים. שוב, היו זהירים מאוד מאוד שלא לגעת ברקמה. קחו את פין שחרור החסימה של הנוזל, לחצו למטה בעדינות כדי להפעיל את הזרימה, ומשם, הקיפו את הרקמה בעזרת העט שלכם.המתינו לייבוש החסם הנוזלי למשך כ-15 שניות. בשלב זה, עלינו להוסיף את הנוגדן הראשוני. השתמשו בפיפטה כדי לוודא כי הרקמה מכוסה בנוגדן הראשוני, והעבירו אותה לקופסה הבקרה ללחות.לכן נשתמש בנייר Kim wipe. נרטיב אותו במעט di water בתוך הקופסה כדי למנוע מהסרטית להתייבש בזמן הדגרה עם הנוגדן הראשוני. כעת, לאחר שהנוגדן הראשוני הודגר במשך שעה, נוציא את הסריטות ונשטוף את עודפי הנוגדן באמצעות PBS.שוב, פשוט אפשרו לנוזל להתנקז והכניסו את הדגימה לשטיפת PBS. ושוב, שטפו שלוש פעמים למשך חמש דקות. לאחר שלושת השטיפות של חמש דקות, נוסיף את הנוגדן המשני לרקמה באותו האופן שבו הוספנו את הנוגדן הראשוני.השתמשו בנפח מספיק כדי לכסות את הרקמות, הוסיפו את הנוגדן המשני, ובמקרה זה אנו משתמשים ב-goat anti rabbit, והחזירו את השקופית לתא הבקרה של הלחות. אנו משתמשים בנוגדן משני, שהוא biotinylated goat anti rabbit, דבר שחיוני כאשר משתמשים בשיטת ה-ABC. העבירו את השקופית לתא הבקרה של הלחות והניחו לה להדגיר למשך שעה אחת.בזמן שנוגדן המשני עובר אינקובציה, עלינו להכין את ריאגנט ה-ABC. אנו משתמשים בריאגנט A, B, C של Vector Laboratories מתוך ערכת Vector Stain. הוציאו את ריאגנט a, בצעו לו פרימינג (prime), וטיפטפו שלוש פעמים לתוך 15 milliliters של PBS, תוך הקפדה לא ללחוץ על השפופרת מכיוון שהטיפות חייבות להיות במינון מדויק ובגודל ספציפי.לאחר שהנוגדן המשני עבר דגירה במשך כשעה, קחו את השקופיות ושטפו אותן שוב ב-PBS, בדיוק כפי שעשיתם עם הנוגדן הראשוני. לאחר שלושה שלבי שטיפה של חמש דקות כל אחד, העבירו את השקופיות למכל זה, שבו תוסיפו את ריאגנט ה-A B, C, שהכנתים 30 עד 45 דקות מראש. הוסיפו את ריאגנט ה-A, B, C למכל, מלאו את השקופיות והניחו להן לעבור דגירה למשך 30 עד 45 דקות נוספות.לאחר שהשקופיות שהו ב-A, B, C במשך כ-3 עד 5 דקות, עלינו לשטוף את עודפי תמיסת A, B, C. לשם כך, הוציאו את השקופיות והעבירו אותן לתמיסת PBS. יש לחזור על הליך השטיפה זה שלוש פעמים ב-PBS, למשך חמש דקות בכל שטיפה.בזמן ששטיפת הנסכים מתבצעת, אני מכין את תת-המצע DAB peroxidase מבית Vector Laboratories. אני לוקח את הבאפר pH 7.5 ומוסיף שתי טיפות ממנו. לאחר הבאפר pH 7.5, אני לוקח את ריאגנט תת-המצע DAB ומוסיף שתי טיפות ממנו.שוב, גודל הטיפה הוא קריטי, לכן אין לסחוט את הבקבוק ויש פשוט לאפשר לטיפות לנפול. שתי טיפות עבור באפר pH 7.5. לאחר מכן, יש להוסיף ארבע טיפות של ריאגנט substrate DAB, תוך מתן אפשרות לטיפות לנפול באופן טבעי.בסיום יש להוסיף שתי טיפות של ריאגנט התשתית מימן פרוקסיד. כך צריכה להיראות תערובת ריאגנט התשתית של ה-DAB. כעת התערובת מוכנה להוספה ללמיות; הוציאו את הלמיות ואפשרו ל-PBS פשוט להתנקז מהן.עם הזמן, ריאגנט ה-DAB הופך לחום יותר. לכן, ברצוננו להוסיף אותו לזהליות בשלב זה. קחו נפח מספיק כדי לכסות את הרקמות והוסיפו אותו ישירות על דגימות הרקמה.כעת קחו את הנפח המתאים והוסיפו אותו ישירות על דגימות הרקמה, והמתינו להתפתחות התמיסה; דגימות הרקמה אמורות להפוך לחומות יותר עם הזמן. לאחר הוספת תמיסת ה-DAB, ניתן לראות בחתך מוחי זה שבהם הרקמה הופכת לחומה כאן וכאן. הצביעה החומה של ה-DAB חושפת את האזור המכיל נוירונים דופמינרגים של המוח האמצעי.לאחר פיתוח השקופיות למשך זמן שבין שתי ל-10 דקות, יש להעבירן למים קרים עם קרח כדי לעצור את התגובה. פשוט הרשוא לתרסיס להתנקז והעבר את השקופיות ישירות למים הקרים עם הקרח. לאחר טבילת השקופיות במים הקרים עם הקרח, העבר את אמבט הצביעה לכיור והזרם לתוכה מים קרים למשך כחמש דקות, כדי להבטיח שכל תמיסת ה-DAB נוקזה מהאמבט.לכן, כאשר אתם מוסיפים את הדגימות לכיור, היזהרו שזרם המים לא יפגע ברקמה, אלא יפגע באחת הפינות ויגרום למים פשוט להישפך, כדי שהרקמות לא יסבלו מהפרעה כתוצאה מזרימת המים. לאחר הוצאת השקופיות מהשטיפה, עליכם לבצע צביעה נגדית. מדוע עשוי להיות צורך בצביעה נגדית?ובכן, סיבה אחת היא שייתכן שתרצו לראות את מבנה הרקמה שלכם. סיבה נוספת היא כדי להמחיש את כל התאים. לכן, למטרותינו, נבצע צביעה נגדית ב-hematoxylin, המשמש לצביעת הגרעינים.כעת עלינו לקחת את השקופיות, להסיר עודפי נוזלים, ולטבול אותן פעם אחת בתמיסת Hemat Hematin. לאחר מכן, יש להוציא אותן ולהעבירן ישירות למים. לאחר הוספת השקופיות למי ברז, יש להחזיק את השקופיות תחת זרם מים, בדיוק כפי שנעשה קודם לכן עם אמבט מי הקרח.עבור שטיפת ההמטוקסילין, פשוט הניחו למים לזרום לתוך הצנצנת עד שהמים בתוכה יהפכו שקופים. לאחר הוצאת השקופיות שצבעו בצבע נגדי מהמים, נרצה לבצע דהידרטציה מחדש של השקופיות. לכן, נעביר אותן שוב דרך סדרת הדילול של האתנול, אך בסדר הפוך.בצעו שטיפה אחת במים דה-יוניים, שטיפה אחת ב-30% ethanol, שטיפה אחת ב-50% ethanol, שטיפה אחת ב-70% ethanol, שתי שטיפות ב-95% ethanol ושתי שטיפות ב-100% ethanol, כאשר כל שלב נמשך שתי דקות. הוציאו את השקופיות, נגבו את עודפי הנוזלים והעבירו אותן ישירות ל-30% ethanol, והמתינו שתי דקות. לאחר שטיפת ה-100% ethanol האחרונה, החזירו את השקופיות לתוך ה-xylene.כעת קחו שוב את השקופיות, גרדו את עודפי הנוזל, והכניסו את השקופיות לקסילן הראשון למשך חמש דקות. אלו יהיו שלושה שטיפות רצופות בקסילן למשך חמש דקות כל אחת. כעת אנו מוכנים להרכיב את השקופיות.לכן, מה שאני עושה בדרך כלל הוא דקה לפני שהשקופיות מוכנות, אני לוקח את הפסטור-פיפט שלי ושואב את תמיסת הקיבוע (perm mount), וממתין כדקה עד שהשקופיות מוכנות להוצאה. לאחר השטיפה האחרונה ב-xylene, תוך הקפדה לא להטביל את הכפפות או להרטיבן ב-xylene, הוצאו אותן בעזרת פינצטה, תוך תשומת לב לאיזה צד פונה הרקמה. נגבו בעדינות את שאריות ה-xylene בעזרת נייר Kimwipe, תוך הקפדה לא לגעת ברקמה; נגבו בזהירות רק את הפינות והקצוות, ואפשרו למרבית ה-xylene להתאדות. ניתן לעבוד ככל הנראה על שתי שקופיות לפני שאחת מהן מתייבשת.כאשר תסיימו לייבש שקף אחד, השקף השני אמור להיות מוכן לעבודה. כעת עליכם לעבוד איתם לפני שהם מתייבשים לחלוטין. לכן, עליכם לקחת את ה-perimount ולשרטט קו דק לצד הרקמה, תוך הקפדה לא לגעת ברקמה.הסירה את ה-perimount יחד עם זכוכית המכסה. הנח אותה בזווית של 45 מעלות ואפשר לה להנמיך. לאחר מכן, גחור את זכוכית המכסה, תוך וידוא שה-perimount מכסה את כל הרקמות.לאחר מכן, הניחו את הזכוכית ולחצו בעדינות במרכז כדי להוציא את כל בועות האוויר העודפות. אפשרו לזה להתייבש בזמן העבודה על רקמה שנייה; זה אינו הזמן לבחון את השקופיות. עלינו לאפשר ל-perma mount להתייבש למשך הלילה לפני בחינת השקופיות.בניגוד לכך, תחת תאורת המיקרוסקופ, ה-perma mount יפתח בועות, ובכך תהרסו את הדגימה שלכם. להלן מבט על חתיכות המוח שלנו לאחר צביעה בחומרים כימיים, נוגדן פוליקלונלי של ארנב המכוון נגד tyrosine hydroxylase. שוב, צביעת ה-DAB החומית מראה את מיקומם של נוירונים דופמינרגיים בג้าน המוח.צביעת הנגד של ההמטין הופכת את כל הגרעינים ברקמה זו לכחולים. כך הראיתי לכם כיצד לצבוע חתכים טבועים בפראפין באמצעות ערכת ה-ABC מ-Vector Laboratories. כעת תרצו להתאים את התנאים בהתאם לסוגי הרקמות שתצבעו ולאנטיגנים שתשתמשו בהם.בהצלחה בניסויים שלכם.

immunohistochemistry-paraffin-sections-using-vectastain-abc-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

כאן אנו מתארים שיטה לכמת הטרוגניות מולקולרית בסעיפים היסטולוגית של חומר הגידול באמצעות immunofluorescence כמותיים, ניתוח תמונה, מדד סטטיסטי של הטרוגניות. השיטה מיועדת לשימוש בפיתוח סמן ביולוגי ניתוח קליני.

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

סרטון זה מתאר את טכניקת הצביעה האימונוהיסטוכימית לזיהוי תאים דנדריטיים מביופסיות אנדוברונכיאליות.

צביעה אימונוהיסטוכימית: שיטה לקבלת מידע מרחבי מקטעי רקמה דקה

סרטון זה מדגים טכניקה לכימות היחס היחסי בין המקרופאגים בין כלל אוכלוסיות תאי החיסון שחדרו בביופסיה של העורק הרקתי. הצביעה האימונוהיסטוכימית של קטע רקמה המושפע ממחלה אוטואימונית מכתימה באופן סלקטיבי את תאי החיסון בקולטנים ספציפיים כדי להבדיל אותם חזותית משאר התאים.

אימונוהיסטוכימיה לחקר הקשר בין מקרופאגים ותאי חיסון חדירתיים

מקור: Núñez, F. J.,  et al.{{}} הערכת סמנים ביולוגיים בגליומה על ידי אימונוהיסטוכימיה על תרביות נוירוספרה תלת-ממדיות של גליומה משובצת פרפין. J. Vis. exp. (2019). סרטון זה מדגים טכניקה אימונוהיסטוכימית לתיוג סמנים ביולוגיים של גידול בנוירוספירות של גידולי מוח משובצים בפרפין. החלקים הנוירוספריים עוברים הסרת פרפין והחזרת נוזלים, ולאחר מכן טיפול לחשיפת אתרי סמנים ביולוגיים. לאחר מכן מוחלים נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לסמן את הסמנים הביולוגיים הללו. הנוגדנים המשניים קשורים על ידי אנזימי פרוקסידאז...

צביעה אימונוהיסטוכימית של סמנים ביולוגיים בקטעי נוירוספירה של גידול מוח

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

פרוטוקול זה מהווה חלופה חסכונית להיבעת פלסמיד דנ"א עירומה עור עכבר. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לספק גנים חיסוניים הקשורות לתוך רקמות עור כדי להתוות את התפקיד הפונקציונלי של גן ספציפי דלקת עורית.

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

כיום, צביעת immunofluorescent על תאים קבוע הוא שיטת הבחירה לקביעת רמות הביטוי חלבון כאשר מידע מורפולוגי נחוץ גם. פרוטוקול זה שהוצגו במסמך זה מספק שיטה חלופית immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע.

קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

שיטת לוקליזציה vivo immunofluorescence ניתן להשתמש כדי לבחון ב vivo biodistribution של נוגדנים ושערי מעלה נוגדן למטרות אונולוגיות באורגניזמים חיים באמצעות שילוב של vivo הגידול מיקוד ולשעבר vivo חיסוני שיטות.

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.

צביעה אימונוהיסטוכימית מולטיפלקס לרקמת סרטן ריאות משובצת פרפין

למדו אימונוהיסטוכימיה בחתכי פרפין באמצעות ערכת ABC Vectastain מ-Vector Labs. הפרוטוקול כולל פתיחת אנטיגנים באמצעות חימום, חסימת פרוקסידזה ודגימת נוגדנים.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

גלה סרטונים נוספים