הערכת היעילות של תרכובת בדיקה אנטי-ויראלית באמצעות בדיקת אינאקטיבציה ויראלית

קח שפופרות עם נגיף הפטיטיס C רקומביננטי, או תרחיף HCV המכיל RNA המקודד מדווח לוציפראז מופרש.

הוסף תרכובת בדיקה אנטי-ויראלית וממס למבחנות הבדיקה והבקרה השליליות.

תרכובות הבדיקה נקשרות לגליקופרוטאינים של HCV, ומשביתות את הנגיף.

לאחר הדגירה, יש לדלל את התערובות כדי למנוע אינטראקציות בין תאים מורכבים בשלבים הבאים.

הוסיפו את התערובות המדוללות הללו לחד-שכבות הפטומה התומכות בשכפול HCV. דגירה.

ה-HCV המומת בתרכובת אינו יכול להיצמד לקולטנים ספציפיים על פני התא, בעוד שגליקופרוטאינים פעילים של HCV נקשרים לקולטנים אלה, מה שמקל על היצמדות תאית.

הסירו HCV לא נספגים. שטפו עם חוצץ והוסיפו מדיה. דגירה למשך זמן ממושך.

ה-HCV הקשור מופנם, משחרר RNA ויראלי ומוביל לסינתזה של חלבון ויראלי ולוציפראז, המופרשים מהתא.

אספו את חומרי העל המכילים לוציפראז. צנטריפוגה ולהוסיף מצע לוציפראז לסופרנטנטים.

לוציפראז מחמצן את המצע ופולט אור.

זוהר גבוה יותר בבאר הבקרה מאשר בבדיקה מעיד על השבתת הנגיף על ידי התרכובת.

כדי להתחיל בבדיקת ההשבתה הוויראלית, ראשית, צלחת 1 כפול 10 עד תאים רביעיים לבאר בצלחת של 96 בארות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה לצורך היצמדות. לזיהום, הכינו נגיף הפטיטיס C או חלקיקי HCV המתויגים על ידי מדווח Gaussia luciferase, כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט.

בשפופרת סטרילית, מערבבים 100 מיקרוליטר של 100 מיקרו-מולרי CHLA או PUG עם 100 מיקרוליטר של 10 ליחידות יוצרות המיקוד הרביעיות או FFU של HCV. לבקרה חיובית, ערבבו HCV עם הפרין בריכוז סופי של 1,000 מיקרוגרם למיליליטר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

לאחר שלוש שעות, יש לדלל את תערובת תרכובות הנגיף פי 50 עם 9.8 מיליליטר מדיום בסיסי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תערובת תרכובת וירוס חדשה, ודללו מיד את התערובת הזו במדיום בסיסי לדגימת הדגירה של אפס שעות. לאחר הוצאת מדיום הדגירה מהתאים, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת תרופת הנגיף המדולל לכל באר בשלוש עותקים.

התמיסה מכילה כעת 10 עד ה-FFU השני לבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות כדי לאפשר זיהום ויראלי של התאים. לאחר הדגירה, הסר את התרחיף הנגיפי מהבארות ושטוף בעדינות את התאים עם 200 מיקרוליטר PBS פעמיים.

דגרו את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי למשך 72 שעות לשכפול הנגיף ושחרור מדווח לוציפראז לתוך הסופרנטנט. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנטים מהתרביות במיקרו-צינורות, וצנטריפוגה ב-17,000 פעמים גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאית. מערבבים 20 מיקרוליטר מכל סופרנטנט עם 50 מיקרוליטר של מגיב בדיקת גאוס לוציפראז, ומודדים את הזוהר מפעילות מדווח הלוציפראז בלומינומטר.