הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

קח צלחת תחתית זכוכית מצופה פולימר המכילה תאי דם אדומים או RBCs דבוקים לפני השטח שלה.

הניחו את המנה על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת, ושמרו עליה בטמפרטורה פיזיולוגית.

הוסף מקרופאגים המכילים פפטידים ציטופלזמיים בעלי תווית פלואורסצנטית הנקשרים לאקטין מפולימר, מה שמקל על הדמיית שלד התא.

במהלך ההדמיה, כוון קרן לייזר בזווית העולה על הזווית הקריטית, מה שגורם להשתקפות פנימית וליצירת גלים חולפים בנקודת המגע.

הגלים החולפים מאירים באופן סלקטיבי את הפלואורופורים בממשק דגימת הזכוכית, ומאפשרים הדמיה בזמן אמת של פגוציטוזיס.

קולטני Fc של מקרופאגים נקשרים ל-RBC אופסוניזציה של IgG, וגורמים להתקבצות קולטנים סביב אזור המגע.

אשכולות מפעילים מסלולי איתות תוך-תאיים והפעלת GTPase, מניעים פילמור אקטין וגיוס דינמין, ויוצרים פסאודופודים.

הפסאודופודים משתרעים סביב ה-RBC ויוצרים פגוציטית.

בסופו של דבר, קצות הפסאודופודים מתמזגים. הדינמין המצטבר מתווך את הפרדת הפגוזום מקרום התא, ומפנים את ה-RBC האופסוני.

לקיבוע לא קוולנטי של ה-SRBCs, שפכו 2 מיליליטר של תאים אופסוניים של IgG לכל אחד מהכלים המצופים פולי-ליזין, וצנטריפוגה את הדגימות בצנטריפוגת רוטור מתנדנדת. השליכו את חומרי העל, ושטפו את החלקיקים פעם אחת עם 2 מיליליטר PBS בתוספת 10% BSA.

לאחר מכן, דגרו את החלקיקים עם 2 מיליליטר PBS טרי בתוספת 10% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 2 מיליליטר PBS. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה- PBS ב -2 מיליליטר של מדיום מיקרוסקופיה ללא סרום של 37 מעלות צלזיוס.

הנח צלחת מקודדת SRBC על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, מגרדים את התאים המעניינים מתחתית צלחת התרבית ופיפטה את התאים כמה פעמים כדי להשיג תרחיף של תא בודד. הוסף את התאים המועברים לצלחת המצופה SRBC.

הפעל את תוכנת הרכישה החיה. מצא תא שמבטא את החלבונים המתויגים פלואורסצנטית והתאם את מיקום הצלחת כך שתא מעניין יהיה באמצע השדה. רכוש 500 תמונות בזוויות שונות מ-0 עד 5 מעלות במרווחים של 0.01 מעלות באורך גל עירור אחד.

כדי לקבוע את הזווית הקריטית עבור האור הפוגע שיוחזר לחלוטין בממשק הזכוכית-מדיום וליצור גל חולף, פתח את רצף התמונה בתוכנת ההדמיה המתאימה. בחר אזור עניין בתא עם פלואורסצנטיות אחידה.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה תמונה, בחר ערימות והתווה פרופיל ציר Z. כדי לשרטט את פרופיל ציר ה-Z ממוצע עוצמת הקרינה הנמדדת באזור העניין עם פונקציית הזוויות על ציר ה-X. לאחר מכן ניתן להשתמש בכל ערך זווית על ציר ה-x העדיף על הזווית הקריטית במהלך הפעלת המיקרוסקופיה כדי לקבל אות TIRF.