Name: טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו את שיטת ההפקה של נוגדני IgY מחלמון ביצה באמצעות שיקוע פוליאתילן גליקול. פרוטוקול זה מספק גישה פשוטה וחסכונית לייצור נוגדנים למחקר אימונולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (פרויקט BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und אני dentifizierung פון bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). אנו מודים ב Diemar (Charité-Universitätsmedizin ברלין, Institut für Pharmakologie) לקבלת סיוע טכני מעולה.

1. פרוטוקול - IgY-מיצוי באמצעים של PEG-משקעים איור. 1 נותן תרשים סכמטי של ההליך IgY-החילוץ (ראה טבלה 2). פרוטוקול תוארה לראשונה בשנת Polson et al. 1980. כל הצעדים צריכים להתבצע באמצעות כפפות לטקס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפת הביצה סדוקה בזהירות את החלמון מועבר "כפית חלמון" על מנת להסיר כמו ביצה לבנה הרבה האפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלמון מועבר נייר מסנן והתגלגל להסיר הנותרים חלבון ביצה, ולאחר מכן העור חלמון הוא חתך עם ניתוח או מכשיר דומה (פיפטה קצה). החלמון הוא שפך לתוך שפופרת 50 מ"ל לבין נפח ביצה רשום (V1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים חלמון ביצה נפח PBS מעורבב עם 6000 (ΣV1 + V2) חלמון לאחר מכן, PEG 3.5% (בשנת גרם, מרסקים) מהנפח הכולל הוא הוסיף vortexed, ואחריו 10 דקות מתגלגל על ​​מערבל מתגלגל. צעד זה של ההליך מיצוי מפרידה את ההשעיה בשני שלבים. אחת שלב מורכב "מוצקים חלמון וחומרים שומניים" (הציטוט המקורי של Polson et al. 1980) ושלב מימית המכילה חלבונים IgY אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצינורות הם centrifuged על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (10,000 סל"ד פי 13,000 XG, הרוטור Heraeus Multifuge 3SR, + זווית קבועה). Supernatant (V3) הוא שפך דרך פילטר מקופל הועבר צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6000 PEG 8.5% בשנת גרם (מחושב לפי נפח חדש) מתווספים הצינור, vortexed והתגלגל על ​​מערבל מתגלגל כמו בשלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4 עם הבדל כי supernatant נמחקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה היא מומס בזהירות באמצעות מקל זכוכית vortexer ב 1 מ"ל PBS. PBS מתווסף נפח סופי של 10 מ"ל (V4). הפתרון הוא מעורבב עם PEG 6000 12% (w / v, 1.2 גרם) ו כאל בשלב 3 (, מערבולת מערבל מתגלגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6 ו לפזר את גלולה בקפידה PBS 800 μl (מקל זכוכית מערבולת). חכו את בועות האוויר להיעלם ולאחר מכן להעביר (פיפטה) תמצית אל כמוסת דיאליזה. יש לשטוף את הצינורית עם 400 PBS μl ולהוסיף נפח למכשיר דיאליזה (V5). (להכנת התקנים דיאליזה ממברנות ראה נספח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית היא dialysed על הלילה מלח 0.1% (1600 מ"ל) ובחש בעדינות באמצעות stirrer מגנטי. למחרת בבוקר, מלוחים הוא הוחלף על ידי PBS ו dialysed לעוד שלוש שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן IgY-לחלץ הוא משך מתוך הקפסולה דיאליזה על ידי טפטפת והועברו צינורות 2ml. הנפח הסופי הוא סביב מ"ל 2 (V6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכולת החלבון (מ"ג / מ"ל) של דגימות נמדד photometrically ב 280 ננומטר (01:50 מדולל PBS) וכן חושבו על פי חוק למברט-באר עם מקדם הכחדה של 1.33 עבור IgY (ראה איור. 2), איור . 4 מראה את איכות של התכשיר (טוהר התאוששות הם סביב 80%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לאחסן את דגימות aliquots ב -20 ° C (לא להקפיא את דגימות ב -70 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכות בהכנות האחרונות מנותח על ידי פשוט SDS-PAGE כמתואר יופיטר פרוטוקול <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. נספח א ', לפני השימוש בשקית הדיאליזה חייבים להיות מוכנים באופן הבא על פי המלצות היצרן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 שקיות דיאליזה נחתכים לחתיכות של 30 ס"מ, נתון בכוס זכוכית 2000 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1750 מ"ל של 5 מ"מ EDTA-הפתרון מתווספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך זכוכית ממוקם מעל השקיות על מנת להבטיח כי שקיות מכוסים על ידי הפתרון EDTA. הפתרון הוא מחוממת מבושל דקות 5 (פלטה). הפתרון הוא יצק את שקיות נשטפים שלוש פעמים במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב 1750 מ"ל EDTA-הפתרון מתווספים, מבושל 5 דקות ושטף שלוש פעמים במים מזוקקים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף השקיות דיאליזה הם מבושל 10 דקות במים מזוקקים ולאחסן ב 4 ° C. קח את שקיות הדיאליזה באמצעות פינצטה מעוקרים. </li></ol> 3. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים סכמטי של מיצוי-IgY באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול פי התיאור המקורי של Polson et al. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">כדי להציג תמונה מוגדלת לחץ כאן.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. פיתוח בסך הכל ב-IgY חלמון ביצה של תרנגולות לחסן התלות של גיל. בהינתן הוא אומר שבועי בסך IgY / ביצה ו SD (n = 4 תרנגולות מטילות). מ [פאולי et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Layiיכולת ניטור ng ארבע תרנגולות שחוסנו עם אנטיגנים שונים. החצים מצביעים על תאריך חיסון (מ [פאולי et al. 2009]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">כדי להציג תמונה מוגדלת לחץ כאן.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Polyacrylamide-Gelelectrophoresis ההכנות IgY בודדים ביצים שונים תחת צמצום התנאים ליין 1 - סמן משקל מולקולרי, ליין 2 - IgY סטנדרטיים, ליין 3-5 - דגימות IgY שונים שהוכנו כמתואר בפרוטוקול. אלה ההכנות האחרונות על פי שלב 10 של פרוטוקול. HC - שרשראות כבדות, LC - chaines אור,? - זיהומים קלים המתאימים משקל מולקולרי סביב 35 kDa (כנראה שבר בטרמינל C-II של מבשר vitellogenin, [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> </td><td> עוף 21 (Antigen) </td><td> עוף 22 (Antigen) </td><td> עוף 19 (B Antigen) </td><td> עוף 23 (ג Antigen) </td></tr><tr><td> מספר ביצים (IgY סה"כ) 1, 2 שנות תקופה </td><td> 625 (38 גרם) </td><td> 626 (38 גרם) </td><td> 545 (33 גרם) </td><td> 608 (37 גרם) </td></tr><tr><td> ביצה מספר (IgY סה"כ), בשנה הראשונה </td><td> 345 (20 גרם) </td><td> 304 (16 גרם) </td><td> 326 (18 גרם) </td><td> 308 (17 גרם) </td></tr><tr><td> ביצה מספר (IgY סה"כ), בשנה השנייה </td><td> 280 (18 גרם) </td><td> 322 (21 גרם) </td><td> 219 (15 גרם) </td><td> 300 (20 גרם) </td></tr><tr><td> % של מקס. ביצה מספר גדול ככל האפשר (שנה ראשונה) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % של מקס. ביצה מספר גדול ככל האפשר (שנה שנייה) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> מספר ביצים מעובדים </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 כמות IgY הכולל מחושב על ידי הכפלת מספר ביצים לפי ערך ממוצע של 60 מ"ג חלבון ביצה על פי נתונים של תרשים 2. 2 מקסימום. מספר הביצים אפשרי בשנה הוא 325 על פי מידע של המגדל. טבלה 1. שנתיים הסטטיסטיקה של יכולת ההטלה של התרנגולות שחוסנו עם אנטיגנים שונים. הנחת קיבולת אחוזים לכל היותר ארבע תרנגולות לאחר חיסון עם אנטיגנים שונים, כמו גם את IgY-התוצאה במהלך שנתיים (ראה גם איור. 3), [פאולי et al. 2009]). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ביצה מס. </td><td> חן Nr. הנחת תאריך </td><td> V1 [מ"ל] חלמון </td><td> V2 [מ"ל] PBS </td><td> 1. PEG prec. [ז] </td><td> כרך [מ"ל] לאחר </td><td> 2. PEG prec. [ז] </td><td> גלולה </td><td> 3. PEG prec. [ז] </td><td> גלולה </td><td> כרך [מ"ל] </td><td> חלבון מ"ג סה"כ / ml </td><td> חלבון הכולל תיקון מ"ג / מ"ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. סינון V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> מומס מ"ל PBS V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> מומסים מ"ל PBS V5 </td><td> אחרי דיאליזה נגד PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הפרוטוקול למופת של PEG משקעים

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי Landesamt פרווה גזונטהייד und Soziales ברלין (H 0069/03).

הבחירה של שיטת IgY מתאים טיהור מושפעת סולם של היטהרות (מעבדה או תעשייה), עלות יעילות, טכנולוגיה (ציוד מעבדה), ואת ההשפעה על הסביבה (ניהול פסולת). שיטות שונות להפקת IgY נסקרו בהרחבה על ידי דה Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, לבדיקה לראות גם שאדה et al. 2005). באופן כללי, השיטות הללו ניתן לחלק לשלוש קבוצות עיקריות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטות רטיבות: מעורבים אמוניום או נתרן סולפט, polyethyleneglycol (PEG), חומצה caprylic ו caragenean. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטות chromatographic: זיקה כרומטוגרפיה, כרומטוגרפיה מחליפי יונים, כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי, כרומטוגרפיה אינטראקציה thiophylic, ואת ג&#39;ל סינון כרומטוגרפיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultrafiltration. </li></ol> טוהר הכנה IgY יכול להיות מוגברת על ידי שילוב של שיטות, למשל, PEG משקעים ניתן לשלב עם זיקה כרומטוגרפיה. במקרים מסוימים, בהתאם ליישום הסופי, תמצית של מים IgY מספיקה כדי להשיג תוצאות טובות (אקיטה &amp; Nakai 1993). על פי הניסיון שלנו, IgY-מדגם נקבל על ידי PEG-משקעים עבד טוב מאוד בהרבה מבחני החיסונית שונים. על ידי סטנדרטיזציה בשיטת PEG-משקעים עוזר אחד טכני הוא מסוגל לעבד כ 84 ביצים בשבוע, אשר מתאים בסכום של IgY הכולל בין 4 ל 7 גרם בשבוע. חישוב פשוט: הנחת תרנגולת הוא מחוסן עם אנטיגן. לאחר חיסונים להגביר כמה תרנגולת מייצר נוגדנים ספציפיים (AB) עם titre של 1:50,000, במשך תקופה של 30 ימים. 30 ביצים x 2 מ&quot;ל IgY לחלץ (ראה פרוטוקול איור. 3) מתאים IgY 60 מ&quot;ל הכולל, אשר בתורו המתאים דילול Ab-l של 3000 (את הקיבולת של הדלי הוא 10 ליטר), זה אומר עם אני 3000 הפתרון Ab 300 דליים יכול להיות מלא. לכן, לאור כמות כזו Ab-עצום אין בעיה לאחסן Ab-הבריכה של איכות סגוליות מתמיד. טכניקה זו מפחיתה את השתנות תשלום / הרבה נצפתה אחרת polyspecific Ab. למרות ההיבט של כמות, IgY Ab יש יתרונות נוספים בהשוואה IgG יונקים: אין הפעלה של מערכת המשלים יונקים, לא תגובתיות צולבת עם HAMA (עכבר אנושי נוגדנים נגד), גורמים שגרונית או אדם קבוצה דם אנטיגנים (חוסר heteroagglutinins). היתרון הבולט של IgY-Ab הוא המרחק שנקרא פילוגנטי. מרחק פילוגנטי הסיבה להבדלים המתואר לעתים קרובות בין ספציפיות Ab של יונקים ועופות, גם כאשר שחוסנו זהה. בנוסף ההבדלים בין יונקים את המערכת החיסונית העופות עצמם, הבדלים בפיתוח פילוגנטי אלה שני מעמדות בעלי חיים תורמת ספציפיות שונות Ab. מחברים אחדים דיווחו כי לעתים קרובות לייצר תרנגולות Abs נגד מבחינה פילוגנטית יונקים חלבונים או פפטידים שמור ביותר ביעילות רבה יותר מאשר לעשות ארנבים (לבדיקה לראות שאדה et א 2005). כתוצאה מכך, נשמרת אנטיגן יכול להישאר &quot;רעולי פנים&quot; למערכת החיסון ארנב, ובכך לגרום רק חלש או תגובה &quot;שקט&quot;. יתר על כן, אם תרנגולות וארנבות הם שחוסנו עם האנטיגן יונקים אותו, לעתים קרובות התרנגולות להגיב עם סגוליות-Ab זה יכול להיות מושגת רק לעתים נדירות ארנבים. גם את ההיבט של רווחת בעלי חיים חשוב מאז Ab הם הלא פולשני מופק חלמון ביצה. בשילוב עם חיסון (הפלסמיד) Gene-Gun IgY הייצור הוא לגמרי לא פולשנית (ויטקובסקי et al. 2009). לסיכום, את הייצור של Ab ב התרנגולות ואת IgY-מיצוי באמצעים של PEG-המשקעים היא מאוד חסכונית תוצאות Ab מאוד ספציפיות עם titres יציב עד 1:1,000,000. בשל המרחק בין פילוגנטי Aves ו יונקים, עופות מסוגלים לייצר Ab ספציפיים נגד אנטיגנים יונקים שמור ביותר לעומת ארנבים למשל. כמות יוצאת דופן של Ab מתקבל על ידי IgY הטכנולוגיה פותח את הדלת גם עבור שימוש IgY-Ab ברפואה אדם ולשימוש וטרינרי למטרות טיפוליות / מניעתי.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyse Visking תיק, סוג 27/32, מנותקים -14 KD, קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלקון צינורות Blue Max, 50 מ&quot;ל Tube פוליפרופילן חרוטי, בקטון דיקינסון labware, פרנקלין לייקס ניו יורק, ארה&quot;ב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקופל סינון MN 615 ¼, ∅ 150 מ&quot;מ, קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה Heraeus </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stirrer מגנטי, Variomag מונו, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-Dialyse-Capsule 5,0 מ&quot;ל, קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוטומטר UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, דואיסבורג, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליאתילן גליקול 6000, Rotipuran הדוקטורט Eur. קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעורבבים מראש PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, מנהיים, גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולר מיקסר SRT2, סטיוארט, סטאפורדשייר, אנגליה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, איקא-Labortechnik, Staufen i.Br., גרמניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפית חלמון, Fackelmann (תופעות houshold), גרמניה </li></ol>

טכנולוגיה igy: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (peg) רטיבות

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

תרנגולות ניתן לחסן באמצעות החיסון im (שריר הפקטוראלי, שמאל וימין, נפח הזרקה 0.5-1.0 מ&quot;ל) או באמצעות חיסון פלסמיד-Gene-Gun. תלוי immunogenicity של האנטיגן, גבוה נוגדנים titres (עד 1:100,000 - 1:1,000,000) יכולה להיות מושגת רק אחרי אחת או 3-4 חיסונים דחיפה. בדרך כלל, תרנגולת מטילה ביצים ברציפות במשך כ -72 שבועות, לאחר מכן פוחתת יכולת הנחת. פרוטוקול זה מתאר את החילוץ של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות הליך משקעים (PEG. Polson et al. 1980). השיטה כוללת שני צעדים חשובים. הראשון הוא הסרת שומנים והשני הוא משקעים של IgY הכולל supernatant של צעד אחד. אחרי דיאליזה נגד חיץ (בדרך כלל PBS) IgY-לחלץ ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה. טוהר לחלץ הוא סביב 80%, את סך IgY לביצה נע בין 40-80 מ&quot;ג, תלוי בגיל תרנגולת הנחת. תוכן הכולל IgY עולה עם הגיל של התרנגולת מן סביב 40 ​​מ&quot;ג / ביצה עד 80 מ&quot;ג / ביצה (ביחס PEG המשקעים). יכולת הנחת תרנגולת בשנה הוא כ 325 ביצים. כלומר, פוטנציאל יבול כולל של IgY גרם 20 שנה בסך הכל / מבוסס על תוכן IgY ממוצע של ביצה 60 מ&quot;ג סה&quot;כ IgY / (ראה לוח 1).

פרוטוקול זה מתאר מיצוי מסוים של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול ונותן מידע כללי על טכנולוגיה IgY.

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

ניתן לחסן תרנגולות באמצעות חיסון תוך-שרירי (Musculus pectoralis, שמאלי וימני, נפח הזרקה של 0.5-1.0 מ"ל) או באמצעות Gene-Gun...

סרטון זה ידגים את בידולם של נוגדני IGY ממרקטים, שניתן לחסן באמצעות הגן gum, פלסמיד, או באופן מסורתי יותר באמצעות הזרקה תוך-שרירית. ראשית, מבודד חלמון הביצה. לאחר מכן משקיעים את הליפידים, ולאחריהם משקיעים פракציית חלבון המכילה את הנוגדים, אשר מבודלים בשלב שקיעה נוסף.לבסוף, הנוגדנים עוברים דיאליזה כנגד PBS. כן. שלום. שמי ארד. זוהי עמיתתי, אדמה, ואנו עובדים כאן במכון הפארמקולוגיה הוותיק והמפורסם, השייך ל-SHA University Medicine של ברלין.בהמשך, נרצה להדגים לכם את מיצוי ה-IGY מביצת תרנגולת, וזוהי שיטה פשוטה מאוד וגם יעילה מאוד מבחינת עלויות. כולנו שייכים למה שמכונה טכנולוגיית IGY. השלב הראשון בהכנת IGY הוא בידוד חלמון הביצה.לביצוע פרוצדורה זו, נזדקק למעמדי מבחנות, לניירות סינון עם מכסים כחולים, לטיפים של פיפט, לבאפר, לכלי בקר מזכוכית, לכף להפרדת החלמון מהחלבון, וכמובן, לביצים. שוברים את הביצה מעל כף החלמון כדי לרוקן את החלבון. לאחר מכן, מנערים בעדינות את כף החלמון המכילה את הביצה כדי להסיר את מרבית החלבון.לאחר מכן מעבירים את החלמון לנייר סינון כדי להסיר את חלבוני החלבון של החלבון במידה המקסימלית האפשרית. קרום החלמון יציב מאוד בביצים שגילן אינו עולה על חודש אחד, לאחר אחסון של יותר משלושה חודשים. קרום החלמון עלול להיקרע כתוצאה מתהליך ההזדקנות במהלך הגלגול על נייר הסינון.לאחר מכן, פותחים את קליפת החלמון באמצעות קצה של פפית ומעבירים אותו למבחנה. לבסוף, ניתן לראות כי לנפח החלמון יש נפח של כ-15 milliliters. נפח זה הוא נורמלי עבור תרנגולת מטילה בוגרת והוא משתנה באופן מינימלי בלבד.נפח החלמון נרשם. 3.5% Polyethylene glycol משמש כחומר משקיע בבופר PBS כדי להפריד את חלבוני החלמון, כולל IGY, מהליפידים שבחלמון הביצה. 1.58 גרם של polyethylene glycol, המקבילים ל-3.5% מנפח החלמון והבופר הסופי, נשקלים על מאזניים. 15 מיליליטר של חלמון מעורבבים עם כמות כפולה של בופר PBS, כך שמוסיפים 30 מיליליטר של PBS לנפח סופי של 45 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים את ה-polyethylene glycol לתערובת.סוגרים את המבחנה ולאחר מכן מערבלים ב-vortex באופן יסודי למשך 20 עד 30 שניות. הופכים את המבחנה מדי פעם במהלך הליך הערבוב ב-vortex.לאחר ערבוב במערבל וורטקס (vortex), החלמון צריך להיות תלוי באופן מלא. כעת מניחים את המבחנות על מערבל גלגלים (roller mixer) למשך 10 דקות. התוצאה היא תערובת הומוגנית שצבעה השתנה מצהוב לצהוב בהיר.כעת סנטריפוגו את התערובת למשך 20 דקות. הסנטריפוגציה מפרידה נוזל עלון (supernatant) צלול המכיל IGY וחלבונים אחרים, ממשקע צהוב המורכב בעיקר מליפידים. בשלב הבא, שופכים את נוזל העלון דרך פילטר מקופל ומעבירים אותו למבחנה חדשה.נפח התמיסה החדש נרשם והמשקע נשפך. כעת, פעם נוספת, מתווסף polyethylene glycol לעלה (supernatant) בריכוז סופי של 12% - כלומר 3.5% בהשקעה הראשונה, בתוספת 8.5% מנפח ה-SNAT שהתקבל, ובסך הכל 12%. לאחר מכן, התמיסה נערבבת ומודגרת במיקסר גלגלים (roller mixer) כפי שבוצע קודם לכן, ומסובבת בצנטריפוגה למשך 20 דקות. בשלב זה, ה-polyethylene glycol משקיע את ה-IGY וחלבונים אחרים.לאחר שלב סבב צנטריפוגה זה, המשקע ישמש להכנה להמסה. מקלוני הזכוכית למשקע מחטאים ב-70% ethanol ובזמן שהמקלוניים מתייבשים, נוזל העל (supernatant) נשלף. לאחר מכן הופכים את המבחנה כדי לנקז את שאריות נוזל העל.לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של PBS למשקע. את המשקע ממיסים באמצעות מקל זכוכית תוך כדי ערבול נמרץ ב-vortex. כעת ניתן לראות תמיסה בעלת גוון צהוב בהיר.כעת, מוסיפים PBS לנפח סופי של 10 milliliters, ולאחר מכן מבצעים שקיעה שלישית באמצעות polyethylene glycol בריכוז של 12%, כפי שבוצע בעבר ובניגוד לסבב הצנטריפוגציה השני. הפעם מתקבל משקע לבן לאחר צנטריפוגציה של 20 דקות. את המשקע (pellet) ממיסים באותו אופן כפי שבוצע קודם לכן, אך בשני שלבים.בשלב הראשון, הוא מומס ב-0.8 milliliters של PBS ומועבר לקפסולת מיקרודיאליזה. לאחר מכן שוטפים את המבחנה עם 0.4 milliliters נוספים של PBS, אשר מועברים גם הם לקפסולה. בשלב הבא, חותכים שק דיאליזה באמצעות מספריים שעברו חיטוי ושוטפים אותו במים מזוקקים.לאחר מכן מניחים את שק הדיאליזה על החלק התחתון של הקפסולה וסוגרים אותו היטב באמצעות החלק העליון. לבסוף, מעבירים את הקפסולות לכלי ביקר מזכוכית המונח על בוחש מגנטי. תמיסת ה-IGY עוברת דיאליזה למשך לילה כנגד 0.1% saline.ביום למחרת, תמיסת ה-IGY עוברת דיאליזה במשך שלוש שעות כנגד PBS. לאחר סיום הדיאליזה, קרום הדיאליזה ננקב באמצעות טיפ של פיפטה, ותמיסת ה-IGY נשפבת ומועברת למבחנה קטנה. הנפח הסופי נרשם.התוצר הסופי הוא תמיסה צלולה, אותה ניתן לאחסן בטמפרטורה של 20°C- למשך מספר שנים. על סמך ניסיוננו, אין לאחסן את תכשיר ה-IGY בטמפרטורה של 70°C- שכן הבחנו באובדן משמעותי של הפעילות בטמפרטורה זו. אנו מקווים שהצלחנו לשכנע אתכם כי מיצוי IDY הוא הליך פשוט ויעיל באמת כאשר פועלים לפי הפרוטוקול שלנו.הציוד הדרוש הוא מינימלי, ואנו מאמינים כי קיים יחס סביר בין המאמץ לתועלת. אני מקווה שפרסום סרטון זה יעודד אתכם לעשות שימוש יעיל בפרוטוקול שלנו וכן בטכנולוגיה, כפי שאני אעשה. תודה לכם.

igy-technology-extraction-chicken-antibodies-from-egg-yolk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה אנו מדגימים משקעים חיסוניים מבוססי נוגדנים של פוספופפטידים מתערובת פפטידים. הפוספפטידים המועשרים מרוכזים בוואקום ומאוחסנים לניתוח במורד הזרם.

העשרת פוספופפטידים: טכניקת משקעים חיסוניים מבוססת נוגדנים להפרדת פפטידים זרחניים ספציפיים מתערובות פפטידים מורכבים

סרטון זה מדגים בדיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים מנוזל תרבית תאים שנאסף מתאי שחלות אוגר סיניות. הוא משתמש בשרף זכוכית נקבובי עם חלבון A משותק, שנקשר לאזור Fc של הנוגדנים בדגימה, ומפריד אותם ביעילות ממזהמים. השימוש במאגר אלוציה בעל pH נמוך מחליש את האינטראקציה, ומקל על שליפת נוגדנים מטוהרים.

טכניקה לטיהור נוגדנים חד שבטיים המיוצרים על ידי תאי שחלה של אוגר סיני

זיהוי מולקולות הקשורות לאזורי עניין גנומיים ספציפיים נדרש כדי להבין את מנגנוני הבקרה של התפקודים של אזורים אלה. פרוטוקול זה מתאר נהלים לביצוע אימון-אופרפריצציה של כרומטין בתיווך מולקולות קשירת DNA (enChIP) לזיהוי חלבונים ו-RNA הקשורים לאזור גנומי ספציפי.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

שיטה זו מספקת מסגרת ללימוד שילוב של חומצות שומן אקסוגני ממקורות מארחים מורכבים לקרומים חיידקיים, בעיקר סטייהילוקוקוס. כדי להשיג זאת, פרוטוקולים עבור העשרת ליפופרוטאין חלקיקים מחלמון ביצת עוף ובעקבות הפרופיל חומצות שומן לאחר מכן של פוספוליפידים חיידקיים ניצול ספקטרומטר מסה מתוארים.

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

מאמר זה מדווח על שיטה פשוטה לבודד את שכבות המשנה החיצוניות והפנימיות של ביצי עוף תוך מזעור השינוי המבני ולייעל את סולביליזציה של חלבונים של כל שכבת משנה לניתוחים פרוטאומיים.

הפרדה מכנית וסלוביליזציה של חלבון של שכבות המשנה החיצוניות והפנימיות של פריוויטלין מביצי חן

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.

סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות להבהרת תפקודם של חלבוני המטרה, וקו-אימונומשקעים (co-IP) יכולים לאשר בקלות PPIs. הדבקנו באופן זמני פלסמיד המקודד חלבון מתויג אפיטופ לתאי HEK-293 ופיתחנו שיטת משקעים חיסוניים כדי לאשר בקלות את הקישור של שני חלבוני מטרה.

משקעים חיסוניים עם ג'ל זיקה נגד תג אפיטופ לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

למדו את שיטת ההפקה של נוגדני IgY מחלמון ביצה באמצעות שיקוע פוליאתילן גליקול. פרוטוקול זה מספק גישה פשוטה וחסכונית לייצור נוגדנים למחקר אימונולוגי.

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

גלה סרטונים נוספים