בדיקה מבוססת תאים להערכת ספיגת חלבון טאו על ידי מיקרוגליה

התחל עם צלחת מרובת בארות עם תחתית שטוחה המכילה מיקרוגליה עכברית דבוקה - תאים פגוציטים במוח.

הכניסו מדיום נטול סרום המכיל אימונוקומפלקסים. קומפלקסים אלה מורכבים מנוגדנים המחוברים לאגרגטים של חלבון טאו זרחני, הנוצרים במהלך מחלות ניווניות מסוימות.

אגרגטי הטאו מסומנים בצבע פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH.

במהלך הדגירה, קומפלקסים אימונולוגיים אלה מקיימים אינטראקציה עם קולטני ה-Fc של תאי מיקרוגליה, מה שמקל על בליעתם.

אנדוזום זה המכיל קומפלקס חיסוני מתמזג עם ליזוזום ויוצר אנדוליזוזום. הסביבה החומצית של האנדוליזוזום גורמת למולקולות הצבע להאיר.

שטפו כדי להסיר את הקומפלקסים החיסוניים הלא מופנמים.

טפל בתמיסת טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים.

העבירו את תרחיף התא לצלחת U-bottom הממוקמת מעל קרח כדי לייצב את האנדוליזוזום. גלולה את התאים והשליך את הסופרנטנט.

שטפו והשעו מחדש את התאים עם מאגר FACS.

באמצעות FACS, זהה את התאים החיים הבודדים וכימת את עוצמת הקרינה הירוקה כדי להעריך את ספיגת הטאו על ידי מיקרוגליה.

ביום הראשון של הניסוי הכינו את תאי BV-2 על ידי שטיפתם תחילה עם PBS 1x בבקבוק שבו הם גודלו. לאחר מכן, דגרו אותם עם 0.05% טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עד שהם מתנתקים מהבקבוק. השעו מחדש את התאים במדיום התרבית על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 3 עד 5 פעמים.

ספרו תאים והכינו תרחיף תאים בריכוז סופי של 100,000 תאים למיליליטר במדיום תרבית המכיל 200 מיקרוגרם למיליליטר הפרין. הוסף 250 מיקרוליטר של תרחיף תאים זה לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של תרבית רקמות בת 96 בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך הלילה.

לאחר הפשרת אגרגטים של צבע טאו pH שהוכנו בעבר על קרח, יש לדלל אותם ב-65 מיקרוליטר לכל מצב של מדיום נטול סרום ליצירת תמיסה של 500 ננו-מולארי. לדלל נוגדנים ב-65 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום כדי להשיג ריכוז כפול מהרצוי. מערבבים אגרגטים ונוגדנים של צבע pH בצלחת תחתונה U של 96 בארות. אטמו את צלחת הדילול הזו ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.

למחרת, הסר את המדיום מצלחת 96 הבארות עם תאי BV-2. שוטפים את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטר טמפרטורת החדר 1x PBS. הסר PBS מלוחית התא BV-2. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 125 מיקרוליטר של קומפלקסים חיסוניים מלוח הדילול לכל באר של צלחת תא BV-2 של 96 בארות, ודגירה במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.

לאחר הדגירה, הסר את הקומפלקסים החיסוניים מהתאים ושטוף את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר 1x PBS. לאחר הסרת ה-1x PBS, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגרו במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבות והשעו מחדש את הבאר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים.

העבירו את התאים לצלחת תחתונה U של 96 בארות וצנטריפוגה אותה ב -400 פעמים גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על קרח ומסירים את המדיום. מוסיפים 150 מיקרוליטר PBS 1x קר כקרח, וצנטריפוגה שוב בחום של 400 גרם למשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת על קרח ושוטפים שוב על ידי הסרת 1x PBS שנוספה בעבר והוספת 150 מיקרוליטר PBS קר כקרח לבאר. שוב צנטריפוגה באותם תנאים.

הניחו את הצלחת על קרח ושטפו את התאים על ידי הסרת ה-PBS שנוסף קודם לכן, והוספת מאגר FACS של 150 מיקרוליטר לבאר. שוב צנטריפוגה בחום של 400 גרם למשך 5 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. הנח את הצלחת על קרח, והסר את מאגר ה-FACS שנוסף קודם לכן, והשהה מחדש את התאים במאגר FACS של 200 מיקרוליטר לבאר. המשך מיד לניתוח על ידי FACS כדי לרכוש 20,000 אירועים בשער התא החי.