Name: לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 34 s
Description: למדו מיקרודיסקציה בלייזר לבידוד רקמות מדויק מדגימות ביולוגיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח תאים ספציפיים במחקרי עצבים ומיקרוסקופיה מתקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

לייזר microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

מיקרוסקופיה לייזר ללכוד, הידוע גם בשם microdissection לייזר (LMD), מאפשר למשתמש לבודד מספר קטן של תאים או רקמות מן קפוא או פורמלין-קבוע, פרפין, מוטבע סעיפים רקמות. טכניקות LMD להסתמך על קרום תרמו יציב או להציב מעל או מתחת, בסעיף רקמות. בשיטה אחת, אנרגיית לייזר ממוקדת משמש כדי להמיס את הממברנה אל התאים הבסיסית, אשר לאחר מכן ניתן הרים מתוך קטע הרקמה. בכל זאת, אנרגיית הלייזר מאדה את נייר הכסף לאורך שביל &quot;נמשך&quot; על הרקמה, דבר המאפשר את התאים שנבחרו ליפול לתוך המכשיר אוסף. כל טכניקה המאפשרת את בחירת התאים עם רזולוציה מינימלית של כמה מיקרונים. DNA, RNA, חלבון, שומנים דגימות יכול להיות מבודד מ ניתח מיקרו ניתח דגימות. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השימוש של לייקה AS-LMD מכשיר לייזר microdissection בשבעה מגזרים, כולל היכרות עם עקרונות של LMD, מאתחל את המכשיר לשימוש, שיקולים כלליים להכנת המדגם, מקבע את הדגימה והקמת צינורות ללכוד , יישור מיקרוסקופ, התאמת שולטת ללכוד, לכידת דגימות רקמה. לייזר ללכוד מיקרו לנתיחה מאפשר לחוקר לבודד דגימות של אוכלוסיות תאים טהור קטן כמו תא ושווי כמה. זה מאפשר ניתוח של תאים של עניין, כי הם ללא מזהמים השכנות, אשר עשוי לבלבל תוצאות הניסוי.

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

מיקרוסקופיית לכידה בלייזר, הידועה גם כמיקרודיסקציה בלייזר (LMD), מאפשרת למשתמש לבודד מספרים קטנים של תאים או רקמות מדגימות קפואות או...

שלום, שמי רוב אדוארדס. אני מנהל מתקן מיקרוסקופיית ה-Laser Capture של אוניברסיטת קליפורניה אירביין. אני אדגים בפניכם את השימוש במיקרוסקופ ה-laser capture שנמצא כאן.המכשיר שלנו הוא Leica A-S-L-M-D, שרכשנו לפני כשלוש שנים. קיימים שני סוגים שונים של מערכות לכידה בלייזר (laser capture). ניתן לדמות את אחת מהן למכונת ריתוך נקודתי, שבה נמצאת פיסת רקמה על עלית זכוכית מעל ממברנת פלסטיק המכסה את הרקמה.לאחר מכן משתמשים במקור לייזר כדי להמיס את הממברנה, ובפועל לבצע ריתוך נקודתי של הרקמה על הממברנה, ולאחר מכן מסירים את הממברנה, יחד עם הרקמה שנלכדה. אוקיי. כדי להפעיל את מערכת ה-LCM, אנו מדליקים מספר מכשירים ברצף כאן. נתחיל עם קופסת הבקרה של ה-A-S-L-M-D, שמופעלת כאן.לאחר מכן נדליק את המחשב בצורה פשוטה. אם יש לכם דגימה הדורשת אופטיקת פלואורסצנציה לצורך זיהוי התאים שיועברו ללכידה, עליכם להדליק את מנורת הכספית להארת הפלואורסצנציה. לא נשתמש בכך בהדגמה זו.אם ברצונך ללכוד תמונות באיכות גבוהה של הדגימות לפני ואחרי, ניתן להדליק את מצלמת ה-spot בנפרד כאן, לאחר הדלקת תיבת הלוגיקה והמחשב; לאחר מכן מדליקים את יחידת בקרת הספק של הלייזר כאן, אשר מופעלת באמצעות מפתח בחלקו האחורי התחתון של המכשיר. ולבסוף, מדליקים את מסך המחשב. על המסך מופיעים מספר בקרים שיהיה עליך להכיר.תשתמשו בהם באופן סדיר למדי. זוהי תוכנה קלאסית המבוססת על Microsoft Windows, ולכן ישנם מספר תפריטים שנדון בהם. אך ראשית, הרשו לי לדבר על שולחן העבודה כאן.קיים חלון שידור חי שיציג לכם את מה שהמיקרוסקופ רואה בפועל. בחלק העליון של סרגל התפריטים כאן, ניתן לראות כפתור לתמונות בזמן אמת, וישנו גם כפתור הקפאה שניתן להפעיל, ולאחר מכן להשתמש בתפריט הקבצים כדי ללכוד תמונות סטטיות של חלק מרקמה, למשל לפני הלכידה ואחריה, כדי לתעד את הרקמה שבידדתם. המיקרוסקופ יכול לפעול במצב שדה בהיר (brightfield) או במצב פלואורסצנציה, בהתאם לשאלה אם אתם לוכדים רקמה עם צביעת נגד של hematin או רקמה צבועה בפלואורסצנציה.שני הכפתורים הבאים כוללים את מצב הדגימה (specimen mode), המתמקד במישור שלב המיקרוסקופ, ולאחר מכן מצב איסוף (collector mode) המזיז את תגית הזכוכית הצידה ומאפשר לכם להדמיות את הרקמה שנלכדה בחלקו העליון של מבחנת האיסוף. זוהי הגדרה מסוג בקרת איכות. בהמשך בסרגל התפריטים מופיעים מספר כלי שרטוט, שבהם תשתמשו כדי לסמן את חלקי הרקמה או התאים שברצונכם ללכוד.ובצד ימין של המסך ישנם כמה כלי שרטוט ולכידה נוספים, הכוללים אפשרויות לצורות שרטוט, אפשרויות חיתוך, וכפתורי בקרת החיתוך. כמו כן, בלוח הבקרה כאן למטה נמצא התקן האיסוף, שהוא החלק של המיקרוסקופ שמתחת לבמה, המחזיק את צינורות ה-einor שבהם נלכדת הרקמה. ארבעת הכפתורים המסומנים באותיות A, B, C ו-D שולטים באיזה צינור יועבר ישירות אל מתחת לדגימה שנלכדת.זוהי דוגמה לרקמה טיפוסית בחתך קפוא שעובדה עבור מיקרו-דיסקציה בשביבת לייזר (laser capture microdissection). אלו הם חתכים קורונליים של ראש עוברי של עכבר שנלכדו על שקופית pen foil. אלו היו חתכים קפואים בעובי שמונה מיקרון אשר יובשו לאחר מכן, נצבעו בצביעת נגד עם hematin ונשמרו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד לשימושם.כדי להניח את הפלחיות הללו על המיקרוסקופ, המיקרוסקופ מגיע עם מחזיק מיוחד, וזכרו שהרקמה תילכד בתוך צינור einor שנמצא מתחת למישור השולחן. לכן, הרקמה נמצאת בצד זה של הפלחית. היא למעשה תונח במחזיק הפלחיות כאשר צד הרקמה פונה כלפי מטה, כך.השקופית נכנסת לשם וננעלת במקומה באמצעות לחץ קפיץ. ואז זהו החור השלם. מחזיק השקופיות מונח עלבמה של המיקרוסקופ בין שני המדריכים הללו.שימו לב שישנו מעצור קטן שנכנס תחת תפס בחלקו האחורי של הבמה ומחזיק את הדגימה במקומה. כאשר הוא מוכנס, ניתן להרגיש נקישה ברורה. כעת, הדבר הבא שיש להכין הוא צינורות ה-einor, שישמשו ללכידת הרקמה.ניתן לבחור בשימוש באבובות איפנדור (Eppendorf) בנפח של 0.2 או 0.5 מיליליטר, והן נכנסות למחזיקים קטנים אלו אשר נכנסים בתורם למגש זה, שמוכנס לחריץ ייעודי מתחת לבמה. כך שהרקמה תילכד למעשה בחלק העליון של פקק אבובת האיפנדור. אני משתמש כאן באבובת 0.5 מיליליטר לצורכי הדגמה.כך מכניסים את הפקק: מחליקים אותו פנימה מתחת, ושפתי הפקק נתמכות על ידי השיניים הללו, ואז הפקק ננעל מתחת באופן הזה, ולאחר מכן כל הפקק נכנס למחזיק. כעת, אם לוכדים חומצות גרעיניות, ובמיוחד עבור בידוד RNA, ניתן להניח טיפה של כמה מאות µL של תמיסת triol ישירות בתוך הפקק. חשוב כמובן לא לשפוך זאת לתוך המכשיר, בשל הפנול וכימיקלים קורוזיביים אחרים הנמצאים בריאגנט ה-triol.זהו בקר המיקרוסקופ כפי שציינתי קודם לכן; העדשות, התאורה והמיקוד במכשיר זה הם ממוטרים באופן מלא. לכן, כפתור המיקוד נמצא כאן למעלה. בקר ההזזה בציר Y עבור הבמה הוא הכפתור הזה.בקרת התאורה של ה-X נמצאת כאן. למטה משמאל נמצא בקר הצמצם, המשנה את עוצמת התאורה; המיקרוסקופ זוכר איזו רמת תאורה הוגדרה עבור כל הגדלה. לכן, כאשר עוברים מעדשה לאخرى, התאורה מותאמת באופן אוטומטי.ולבסוף, בצד ימין של הבקר נמצא בורר העדשות, המשמש למעבר בין העדשות. במכשיר זה יש חמש עדשות: 4x, 10x, 20x, 40x ו-63x. השלב הראשון בתהליך לכידת הרקמה הוא כיוון המיקרוסקופ, כך שמה שרואים על המסך יהיה בדיוק מה שיילכד, לצורך כיוון המיקרוסקופ.נעבור לאפשרות תפריט הלייזר ונבחר בכיול (calibrate), ולאחר מכן נלחץ על המשך (continue). כעת אני בהגדרת 4x, וניתן לראות שקיים כאן שטח ממברנה גדול יחסית. שימו לב שאין כאן רקמה.אנו מבצעים את הכיוון בפינה אחת של העגלה. הלייזר חרת סימון של רשת (crosshatch) בפינה הימנית העליונה של המסך; אשתמש בעכבר כדי למרכז אותה במסך ואז אלחץ, והמחשב יחרת סימון רשת נוסף. אבצע כיוון ביחס לסימון זה ואלחץ, ולאחר מכן המחשב יחרת סימון רשת שלישי ואנו נבצע כיוון לפיו.כיול עדשת העצם פי 4 עבור המיקרוסקופ הושלם כעת, הוא מכוון ומוכן לצילום רקמה בפועל. ייתכן שהבחנתם במהלך תהליך הכיוון כי החריצים שנחתכו היו עבים למדי. זאת משום שהספק של בקרת הלייזר היה מכוון להגדרה גבוהה מאוד.ככל הנראה איננו זקוקים לרמת עוצמת חיתוך כזו. לכן, אדגים כיצד מתאימים את עוצמת הלייזר על ידי חיתוך קו. אם אשרטט ביד חופשית קו אלכסוני על המסך, ואז אבחר פקודה מתאימה ואלחץ על "התחל חיתוך" (start cut), המחשב יחתוך לאורך הקו שהגדרתי.ניתן לראות עד כמה הקו הזה רחב. אני צריך להפחית את הספק הלייזר. לכן אעשה זאת.אני ניגש לתפריט הלייזר, נכנס לבקרה ותשימו לב שהעוצמה היא במקסימום. אני עומד להפחית את עוצמת הלייזר לכ-30 בערך ואאשר את ההגדרה הזו. כעת, אם אשרטב קו חדש ואחתוך אותו, תראו שרוחב הרקמה השרופה או הממברנה השרופה קטן במידה ניכרת.לכן, כעיקרון כללי, יש להגדיר את הספק הבקרה של הלייזר להגדרה הנמוכה ביותר האפשרית, כדי למזער את כמות הרקמה שעוברת אידוי. כעת אדגים את הלכידה בפועל של דגימת רקמה באמצעות עינית מראה זו. אני נמצא כעת בעדשה אובייקטיבית של 4x ואנסה ללכוד חלק גדול יחסית של רקמה.נבודד את העדשה כולה ממרכזו של העין. כדי לעשות זאת, אבצע חיתוך ביד חופשית. לכן, באמצעות בקר הציור בחלקו העליון של המסך, אבצע את החיתוך.אני אשרטט קו מסביב לדגימה שיש ללכוד. אני עושה זאת בהגדלה נמוכה מאוד. אם יש עניין בחיתוכים מדויקים יותר או באזורי רקמה קטנים יותר, ניתן כמובן לבצע לכידה בהגדלה גבוהה יותר.בחרתי את השטח המיועד לחיתוך, ובתוך תפריט שרטוט הצורות, אני בדרך כלל משאיר את אפשרות הקווים הסגורים מופעלת. מה שאפשרות הקווים הסגורים עושה הוא שבמידה ומשרטטים צורה לא סדירה סביב אובייקט ולא סוגרים אותה לחלוטין, המערכת משרטטת קו ישר בין הקצוות הפתוחים של הצורה. לאחר זיהוי השטח לחיתוך, נתחיל בתהליך החיתוך, ותראו שתיבת הבקרה ממקדת את הלייזר דרך השטחים והוא חותך אותם כמעט לחלוטין.לעיתים קרובות נוצר מצב של "hanging Chad" (רקמה לא מופרדת במלואה) בעת לכידה של פיסות רקמה גדולות. במצב זה לא מתבצעת הפרדה מלאה של הרקמה. לכן, הפעולה הראשונה שיש לנסות היא פשוט לחתוך אותה שוב, והלייזר יעקוב אחר היקף הרקמה.לעתים ניתן לחלופין, פשוט במקום שבו הרקמה תלויה, לסמן מרווח קטן, לגזור אותו, ואז היא תיפול. וכך לכדנו כעת את חלק זה של הרקמה. כפי שציינתי קודם לכן, נוכל לעבור למצב איסוף (collector mode) ולוודא שפיסת הרקמה נמצאת אכן באספן או במכסה של מבחנת ה-einor.כעת אגיע לכפתור הבקרת האספטור (collector control), אלחץ עליו, ותראו שהמיקרוסקופ ישנה את התצוגה. כעת אנו מביטים במשטח הפנימי של צינור ה-einor, וניתן לראות את פיסת הרקמה שנלכדה בחלק הימני התחתון של המסך, ואף ניתן לבצע פוקוס ולראות את התאים הבודדים. כך אימתנו כי אכן לכדנו את הרקמה שבחרנו.כעת, תהליך הלכידה אינו מתבצע ביעילות של מאה אחוזים, מכיוון שרקמות אלו הנלכדות הן למעשה כעלים נופלים. אחוז קטן מסוים של רסיסי רקמה נלכדים לא יפלו בתוך מכסה שפופרת ה-einor, אך שיעור האובדן הוא נמוך מאוד ברגע שמסיימים ללכוד את הרקמה הרצויה. השלב הבא, כמובן, הוא להוציא את שפופרת ה-einor עם הרקמה הנלכדת מהמכשיר ולסגור אותה היטב במכסה.וכדי לעשות זאת, אנחנו מושכים בעדינות רבה את התפס החוצה בקו ישר, כך. לאחר מכן, תוך כדי שמירה על מכסה המבחנה במצב אנכי, מסירים את התפס מהמגש ואז מושכים את המבחנה החוצה בעדינות רבה. מחליקים כך, מוציאים מהתפס ואז מזיזים את המבחנה, ולא את המכסה, בצורה זו.כעת, אם כבר הנחת טיפה של triol במכסה, הרקמה שלך כבר תתחיל בתהליך ההמסה ותוכל לחזור למעבדה ולהשלים את בידוד ה-RNA. ישנם מספר יצרנים המייצרים ערכות לבידוד RNA בקנה מידה מיקרוסקופי, כאשר Amon הוא היצרן שאנו מעדיפים. וזהו כל התהליך.כך שהיום הובלתי אתכם בסיור במעבדה למיקרוסקופיית לכידה בלייזר כאן ב-uc Irvine. הדגמנו כיצד ללכוד רקמות בחתכים קפואים משקופיות מצופות ב-pen foil כהכנה לבידוד RNA מהרקמה האמורה. תודה על תשומת לבכם ובהצלחה בביצוע ה-laser capture Microdissection שלכם.

laser-capture-microdissection-of-mammalian-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסרטון מתאר את נתיחת הלייזר של מודל התרבות המשותפת האורגנוטיפית התלת-ממדית ברמת המיקרון. במודלים אורגנוטיפיים תלת-ממדיים, מרכיבי סטרומה כגון פיברובלסטים מתורבתים בתרבית תלת-ממדית עם תאי אפיתל סרטניים. המודל התלת-ממדי משמש ככלי ניסיוני המאפשר לחקור פלישה ואינטראקציות סרטן-סטרומה בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

מיקרודיסקציה בלייזר: טכניקה לבידוד תאי סרטן מעי גס פולשים ממודל תרבית אורגנוטיפית תלת-ממדית

Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר כשיטה יעילה לבידוד אוכלוסיות טהורות של סוגי תאים מרקמות ערמונית הטרוגניות לצורך ניתוח RNA במורד הזרם.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור microdissection לכידה לייזר לשחזור (LCM) לבידוד meshwork trabecular (TM) לניתוח RNA במורד הזרם. היכולת לנתח שינויים בביטוי הגנים ב ה-TM יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מחלות עינית הקשורות TM.

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה בתפוקה גבוהה לסגמנטציה מונחית בינה מלאכותית של אזורי עניין שאושרו על-ידי פתולוגיה מתמונות מוכתמות ודקות של מקטעי רקמה להעשרת אוכלוסיות תאים שנפתרו על-ידי היסטולוגיה באמצעות מיקרו-דיסקציה של לייזר. אסטרטגיה זו כוללת אלגוריתם חדשני המאפשר העברת תיחום המציין אוכלוסיות תאים בעלי עניין ישירות למיקרוסקופי לייזר.

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

למדו מיקרודיסקציה בלייזר לבידוד רקמות מדויק מדגימות ביולוגיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח תאים ספציפיים במחקרי עצבים ומיקרוסקופיה מתקדמת.

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

גלה סרטונים נוספים