טכניקה לתרבית תאי עצב בהיפוקמפוס עכבר

קח היפוקמפוס גור עכברים שנקטף במאגר.

חותכים את ההיפוקמפוס לשברים קטנים יותר ומעבירים אותם לצינור חרוטי.

שוטפים את הרקמה עם חיץ. לאחר שהשברים מתייצבים, הסר את המאגר. כעת, הוסף בופר טרי וטריפסין.

במהלך הדגירה, טריפסין, אנזים פרוטאוליטי, מעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, ומשחרר את תאי העצב בהיפוקמפוס.

שוטפים את הרקמה המעוכלת עם חיץ.

לאחר שהשברים מתייצבים, הסר את המאגר. הוסף חיץ טרי ופיפטה את הרקמה שוב ושוב כדי לנתק אותה מכנית, ולקבל תרחיף של תא בודד.

לאחר שהרקמה הלא מעוכלת מתייצבת, העבירו את תרחיף התאים על כיסויים מצופים פולי-L-ליזין עם תומכי שעווה בתוך צלחת תרבית המכילה מדיה.

התאים מתחברים למשטחים המצופים בפולי-L-ליזין באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות.

כעת, הנח את הכיסויים המודבקים לתאי העצב עם הפנים כלפי מטה לתוך צלחת המכילה תאים גליאליים או לא עצביים בקליפת המוח במדיה נטולת סרום.

בתרבית, שעווה תומכת במניעת מגע ישיר בין תאי עצב לתאי גליה, ויוצרת מיקרו-סביבה שבה גורמים המופרשים מתאי גליה מקדמים הישרדות והתבגרות של תאי עצב

.

כדי להתחיל, נתחו שישה עד שמונה היפוקמפוס מגורים בני יום אחד לאחר הלידה עם מדיום HBSS בצלחת פטרי. קוצצים את ההיפוקמפוס בעזרת מספריים לחתיכות קטנות יותר, ומעבירים אותם מהצלחת לצינור של 15 מיליליטר. שוטפים את ההיפוקמפוס פעמיים עם 5 מיליליטר HBSS, ומשאירים אותם ב -4.5 מיליליטר HBSS לאחר הכביסה.

הוסיפו 0.5 מיליליטר של 2.5% טריפסין ל-4.5 מיליליטר של HBSS, ודגרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, והפכו את הצינור כל 5 דקות. היפוקמפוס מעוכל היטב אמור להיות דביק וליצור אשכול. במידת הצורך, האריכו את העיכול למשך 5 דקות נוספות.

שטפו את ההיפוקמפוס עם HBSS שלוש פעמים למשך 5 דקות בכל שטיפה. לאחר הכביסה מוסיפים 2 מיליליטר HBSS, ומעבירים את ההיפוקמפוס למעלה ולמטה בעזרת פיפטה פסטר 15 פעמים. יש לשלוש את הרקמה עם פיפטת פסטר מלוטשת באש 10 פעמים, ולהניח את הצינור למשך חמש דקות עד שכל הנתחים מתייצבים לתחתית. חזור על הטריטורציה עם הנתחים הנותרים עד שרובם נעלמים.

לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה של 1 מיליליטר כדי להעביר בעדינות את הסופרנטנט שמכיל את תאי העצב המנותקים לצלחות ציפוי. מוסיפים אותו ישירות למדיום הציפוי המודגר מראש ומנערים את הצלחת בעדינות. שעתיים עד 4 שעות לאחר הזריעה, בדוק את כלי הציפוי במיקרוסקופ קל. רוב הנוירונים היו צריכים להיות מחוברים לכיסוי.

בעזרת מלקחיים בעלי קצה עדין, הפוך את הכיסויים לכלי הזנת תאי הגליה המכילים מדיום תרבית עצבית מותנה מראש כאשר צד נקודת השעווה פונה כלפי מטה. תאי עצב יכולים לגדול בכלי ההזנה של תאי הגליה עד חודש אחד. האכילו נוירונים כל שבעה ימים במיליליטר אחד של מדיום תרבית עצבי טרי.