יצירת תרבית נוירונים ראשונית בצפיפות נמוכה מתאי עצב עובריים קפואים

התחל עם קריוביאל המכיל נוירונים עובריים שמורים בהקפאה והנח אותו בבלוק חימום להפשרה מבוקרת.

לאחר מכן, העבירו את הנוירונים המופשרים לתוך צינור ודללו אותם עם תווך נוירו-בסיסי טיפה כדי לאזן את הלחץ האוסמוטי ולמנוע ליזיס תאים.

זה יוצר תרחיף הומוגני עם נוירונים מפוזרים באופן אחיד.

זרע את התרחיף העצבי המדולל על צלחת מרובת בארות מצופה פולי-ליזין המכילה מדיום נוירו-בסיסי מועשר בחומרים מזינים ואנטיביוטיקה.

דגירה כדי לאפשר לפולי-L-ליזין הטעון חיובית לקיים אינטראקציה עם הנוירונים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, מה שמקל על היצמדותם.

ספק לבארות מדיה נוירו-בסיסית טרייה.

דגרו את התאים באותה מדיה בתנאים לחים כדי למנוע אידוי מדיה.

הנוירונים העובריים מנצלים את חומרי המזון וגדלים על ידי פיתוח תהליכים עצביים ויצירת נוירונים ראשוניים.

המדיום הנוירו-בסיסי שומר על הנוירונים הראשוניים המופיעים במרווחים רחבים, ויוצר תרבית ראשונית בצפיפות נמוכה עם קשרים עצביים.

התחל בציפוי מיקרופלייט של 96 בארות עם 100 מיקרוליטר פולי-L-ליזין לבאר. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, הסר את תמיסת הפולי-L-ליזין. שוטפים את הצלחות פעמיים במים מעוקרים ופעם אחת עם מדיום תרבית טרי ללא תוספים. מניחים את הצלחות לייבוש. ניתן לעטוף צלחות יבשות ולאחסן עד חודש בחום של 4 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בזריעת תאים, הוסף 50 מיקרוליטר ממדיום התרבות לכל באר בצלחת המצופה. מלאו את הבארות ההיקפיות ב -200 מיקרוליטר מים מעוקרים ודגרו את הצלחת למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

הסר את הנוירון קריוביאל ממיכל החנקן הנוזלי והנח אותו בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר חלקית את תכולתו. בעזרת פיפטה של 1 מיליליטר עם קצה קדח רחב, העבירו לאט את תכולת הבקבוקון טיפה לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. שוטפים את הקריוביאל הריק עם 1 מיליליטר של מדיום תרבית בטמפרטורת החדר. העבירו את תמיסת השטיפה לצינור של 50 מיליליטר המכיל את תרחיף התאים.

לאחר מכן, הוסף 9 מיליליטר של מדיום התרבות בטמפרטורת החדר בטיפה לתוך הצינור של 50 מיליליטר, ומהווה את הנפח ל -11 מיליליטר. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר, העבירו את תרחיף התאים למאגר. כעת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית עם קצות קדחים רחבים, הוצא את מתלה התא עם ספירה סופית של 1.0 x 10⁴ תאים לבאר לתוך צלחת 96 הבארות המצופה.

דגרו על הנוירונים למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן החלף את מדיום התרבות ב -100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שחומם מראש ודגר שוב באותם תנאים.