גידול נוירונים מעוררים פלואורסצנטיים ממוחו של גור עכבר מהונדס

קחו למשל מוח של גור עכבר טרנסגני.

הסר את המוח הקטן ונתח את המוח. הפרד את רקמת הקורטיקו-היפוקמפוס המכילה נוירונים מעוררים המבטאים חלבון פלואורסצנטי.

העבירו את הרקמה לצלחת תרבית המכילה חיץ.

טוחנים את הרקמה ומעבירים אותה לצינור המכיל פפאין.

פפאין מעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, ומשחרר תאים, כולל נוירונים.

מעבירים את הרקמה המעוכלת לצינור עם חלבוני BSA, עוצרים את הפעילות האנזימטית ומונעים נזק לתאים.

לנתק את הרקמות באופן מכני ולשחרר תאים.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט המכיל פסולת ואנזימים.

השעו מחדש את התאים במדיה עצבית פלואורסצנטית נמוכה וסננו דרך מסננת תאים, והסירו אגרגטים של תאים.

בצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות כדי לזהות ולמיין את הנוירונים הפלואורסצנטיים.

העבירו את הנוירונים הממוינים לצינור מיקרו-צנטריפוגה ולצנטריפוגה. השעיית נוירונים במדיה עצבית.

נוירונים זרעים על כיסויים מצופים פולי-L-ליזין בצלחת מרובת בארות. נוירונים נצמדים למשטחים המצופים.

הוסף מדיה עצבית. דגירה כדי להקל על צמיחה עצבית.

ראשית, נתחו את המוח הקטן והפרידו בין שתי ההמיספרות. לאחר מכן, הפרד בזהירות את ההיפוקמפוס וקליפת המוח מכל חצי כדור. העבירו את הרקמה המנותחת לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה מאגר תרבית תאים מקורר.

לאחר מכן, העבירו את ההיפוקמפוס וקליפת המוח המנותחים למכסה של צלחת פטרי נוספת בגודל 35 מילימטר. בעזרת הקצה השטוח של להב אזמל, קוצצים בזהירות את הרקמה בתנועה צולבת עד שנשארות רק חתיכות קטנות.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה הקצוצה עם כמות קטנה של תמיסת פפאין ממכסה צלחת הפטרי לצינור הפפאין הסטרילי. דגרו על הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות. לאחר דגירה של פפאין, העבירו את צינור הפפאין הסטרילי וצינורות ה-BSA הסטריליים לארון הזרימה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה פסטר בנפח 1 מיליליטר כדי להעביר רק את רקמת הקורטיקו-היפוקמפוס מצינור הפפאין לתוך צינור BSA 1.

על מנת לפרק גושי רקמה גדולים, יש לשלש את הרקמה מספר פעמים באמצעות פיפטה פסטר בנפח 1 מיליליטר. לאחר מכן, יש לשלש את הרקמה שבע פעמים באמצעות פיפטת פסטר עדינה. לאחר 30 שניות, העבירו 1 מיליליטר מהתמיסה התחתונה והרקמה מצינור BSA 1 לצינור BSA 2.

יש לשלש את הרקמה בשפופרת BSA 2 מספר פעמים באמצעות פיפטת פסטר עדינה. לאחר טריטורציה, העבירו 1 מיליליטר מהרקמה התחתונה בתמיסה מצינור BSA 1 לצינור BSA 3. יש לשלש את הרקמה בצינור BSA 3 מספר פעמים.

לאחר טריטורציה, העבירו את כל התמיסה והרקמות מצינורות 2 ו-3 לתוך צינור BSA 1. יש לשלש 2 עד 3 פעמים נוספות ולצנטריפוגה ב -3,000 פעמים גרם למשך 3 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט מרקמת הכדורים והשהה מחדש את התאים באמצעות פיפטה P1000 ב-2 מיליליטר של מדיום שינה שלם A פלואורסצנטי נמוך. לאחר מכן, יש לשלש את הרקמה 20 פעמים כדי להבטיח השעיה מלאה של תמיסת הרקמה.

לאחר מכן, סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תא של 30 מיקרומטר לתוך צינור דגימת פוליסטירן. הכן צינורות איסוף למיון תאים על ידי פיפטינג של 300 מיקרוליטר של מדיה Hibernate A שלמה למספר הנדרש של צינורות פוליפרופילן.

עבור כל סוג תא פלואורסצנטי שיש למיין, בחר את מסנני העירור והפליטה המתאימים. לעורר חלבון ורידי באמצעות אורך גל עירור של 488 ננומטר ולזהות את האור הנפלט באמצעות סט מסנני פליטה של 530 מעל 40.

לעורר חלבון TdTomato באמצעות אורך גל עירור של 531 ננומטר ולזהות את האור הנפלט באמצעות סט מסנני פליטה של 575 מעל 30. לטוהר גבוה, מיין תאים פלואורסצנטיים עם תוויות בהירות. לאחר מיון התאים, העבירו את התאים שנאספו לצינורות צנטריפוגה תחתונים עגולים של 2 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים בעוצמה של 3,000 פעמים גרם למשך 3 דקות ליצירת כדור תא.

השהה מחדש את גלולת התא בכמות הנדרשת של מדיום NBA שלם שחומם מראש כדי להשיג צפיפות תאים של 1,000 תאים למיקרוליטר. כדי לאשר את נוכחותם של תאים מנותקים, בדוק את תמיסת התא במיקרוסקופ באמצעות עדשת אובייקטיבית פי 4 או פי 10. לפני ציפוי התאים, מערבולת במהירות בינונית למשך 2 עד 3 שניות כדי להבטיח השעיית תאים אחידה.

לאחר המערבולת, פיפטה במהירות 10 מיקרוליטר מתרחף התא למרכז כל כיסוי. לאחר שעה, האכילו את התאים ב -500 מיקרוליטר של מדיום NBA שלם שחומם מראש והחזירו לחממה ב -37 מעלות צלזיוס.