התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לתרבית תלת-ממדית באמצעות פיגום נקבובי

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה תוספת נקבובית המחזיקה פיגום פוליסטירן בעל מבנה נקבובי תלת מימדי.

הוסף אתנול כדי להחזיר לחות לפיגום ולשטוף אותו עם המדיום.

הכניסו מדיום המכיל חלבון מטריקס חוץ-תאי, למינין. דגירה כדי לאפשר למינין לצפות את הפיגום.

זרעו את תאי הגזע העצביים האנושיים בתווך עצבי המכיל גורמי גדילה על הפיגום המצופה למינין.

דגירה כדי לאפשר נדידת תאי גזע לפיגום הנקבובי שבו הלמינין מקדם את היצמדות התאים לפיגום.

התאים מנצלים את גורמי הגדילה ומתרבים בתוך פיגום זה.

הוסף מדיום עצבי נטול גורמי גדילה והחלף באופן קבוע את המדיום המושקע כדי לשמור על כדאיות התא.

היעדר גורמי גדילה ממריץ את ההתמיינות של תאי גזע לתאי אב עצביים.

עם הזמן, התהליכים העצביים של תאי אב אלה מתארכים, ומאפשרים צמיחת תאים רב כיוונית ויוצרים תרבית תלת מימדית.

הרטיבו את הפיגומים על ידי הוספה לכל באר של צלחת 12 בארות Alvetex, 2 מיליליטר של 70% אתנול, שהוכנו באמצעות מים להשקיה. הימנע מלגעת בפיגומים על ידי הוצאת 70% אתנול במורד הקיר של כל באר. שאפו בזהירות את האתנול 70% ושטפו מיד את הפיגומים עם 2 מיליליטר לבאר DMEM F12 למשך דקה אחת.

חזור על הליך הכביסה פעמיים. שאפו בזהירות את ה-DMEM F12 לאחר הכביסה הסופית. מצפים את הפיגומים על ידי הוספת 2 מיליליטר למינין ב- DMEM F12 לכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים לפחות.

לאחר מכן, שטפו את הצלחת עם DMEM F12 חם. זרע כל פיגום עם כ-500,000 תאי גזע עצביים אנושיים או HNSCs בנפח של 150 מיקרוליטר של מדיום RMM עם גורמי גדילה. דגרו על הצלחת למשך שלוש שעות כדי לאפשר לתאים להתיישב בפיגומים.

לאחר שלוש שעות, הוסף 3.5 מיליליטר RMM לכל באר, והקפיד לא לעקור תאים מהפיגומים. דגרו על הצלחת למשך שבעה או 21 יום. החלף את המדיום לאחר יום אחד, שהוא ההאכלה הראשונה, והחלף את המדיום שוב 2-3 ימים לאחר ההאכלה הראשונה.